動物血小板線粒體粗提分離試劑盒產品說明書 

主要用途

動物血小板線粒體粗提分離試劑是一種旨在通過低速差速離心和化學滲壓休克處理純化血小板、以及物理或化學破膜和高速差速離心的方法，直接從動物血細胞中分離出完整而純化的血小板線粒體細胞器，然后進一步生物酶處理以獲得高質量的線粒體DNA的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。各種動物血細胞中血小板線粒體核酸成分處理。用于后續的雜交、克隆、酶切、PCR分析等。產品即到即用，操作簡易，性能穩定，無核酶污染，萃取純度和產量皆高。

技術背景

線粒體細胞器的研究是現代細胞生物學的zui重要的課題之一。線粒體成為生物衰老、古生物、細胞凋亡、腫瘤、HIV、老年癡呆癥、糖尿病、肌肉疾病等研究的主要對象。線粒體DNA的分離和定量以及突變分析是研究中*的。 

產品內容

清理液（Reagent A）   500毫升

裂解液（Reagent B）    80毫升

凈化液（Reagent C）    20毫升

強化液（Reagent D）    10毫升

保存液（Reagent E）   100毫升

破膜液（Reagent F）          6毫升

去干擾液（Reagent G）   600微升

酶解液（Reagent H）   600微升

萃取液（Reagent I）     6毫升

濃縮液（Reagent J）     2毫升

助沉液（Reagent K）    20微升

沉淀液（Reagent L）    20毫升

純化液（Reagent M）    20毫升

緩沖液（Reagent N）     1毫升

產品說明書 1份

保存方式

保存凈化液（Reagent C）、去干擾液（Reagent G）、酶解液（Reagent H）、萃取液（Reagent I）和助沉液（Reagent K）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

4℃（微型）臺式離心機：用于樣品操作

4℃超速離心機：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

超聲儀：用于裂解細胞

58℃恒溫水槽：用于孵育反應物

實驗步驟

• 血小板線粒體制備
• 物理處理法

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標記為裂解工作液。然后進行下列操作。

• 準備1個無菌的50毫升錐形離心管
• 輕輕混勻10至20毫升新鮮（2小時內抽取的靜脈血）的抗凝全血樣品
• 移入到50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群
• 用手指輕彈離心管2至3下，使細胞顆粒群松動
• 加入10毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液合并到上述50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群（扔掉含有細胞顆粒群的離心管）
• 放入含有上清液的離心管到臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群（扔掉含有細胞顆粒群的離心管）――此步驟獲得血小板富集血清
• 放入含有上清液的離心管到臺式離心機離心20分鐘，速度為2000g
• 可見白色沉淀顆粒群，小心抽掉上清液
• 加入10毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放入臺式離心機離心20分鐘，速度為2000g
• 小心抽去上清液（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進－70℃冰箱里）――此步驟獲得純化的血小板
• 加入5毫升預冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿幫勻化細胞（約20至40下）（注意：參見注意事項11）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）置于超聲儀槍頭下，離心管在冰槽里
• （選擇步驟）超聲功率為60％（或150赫茲）猝擊10秒，間隙30秒，10個循環
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• 化學處理法

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標記為裂解工作液。然后進行下列操作。

• 準備1個無菌的50毫升錐形離心管
• 輕輕混勻10至20毫升新鮮（2小時內抽取的靜脈血）的抗凝全血樣品
• 移入到50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群
• 用手指輕彈離心管2至3下，使細胞顆粒群松動
• 加入10毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液合并到上述50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群（扔掉含有細胞顆粒群的離心管）
• （選擇步驟）放入含有上清液的離心管到臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• （選擇步驟）小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群（扔掉含有細胞顆粒群的離心管）――此步驟獲得血小板富集血清
• 放入含有上清液的離心管到臺式離心機離心20分鐘，速度為2000g
• 可見白色沉淀顆粒群，小心抽掉上清液
• 加入10毫升預冷的清理液(Reagent A)，混勻細胞顆粒群
• 放入臺式離心機離心20分鐘，速度為2000g
• 小心抽去上清液（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進－70℃冰箱里）――此步驟獲得純化的血小板
• 入5毫升預冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入500微升預冷的強化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項12）
• 加入5毫升預冷的保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

• 線粒體DNA萃取
• 加入300微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
• 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
• 轉入1.5毫升離心管
• 置入冰槽中孵育15分鐘 
• 加入30微升去干擾液（Reagent G）
• 用200微升槍頭上下抽吸混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育15分鐘
• 加入30微升酶解液（Reagent H）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進58℃恒溫水槽或干式恒溫儀孵育2小時（注意：可以孵育4至16小時，增加萃取產量） 
• 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態（或置于冰槽里15至30秒）
• 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前搖勻）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 加入100微升濃縮液（Reagent J）
• 加入1微升助沉液（Reagent K）
• 加入800微升沉淀液（Reagent L）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩15秒，充分混勻
• 放進微型臺式微型離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升純化液（Reagent M）
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入20微升緩沖液（Reagent N）
• 溶解后放進－20℃冰箱保存或移出2微升進行PCR反應

注意事項

• 本產品為20次（10至20毫升全血/次）操作
• 其它實際操作的全血容量與試劑使用量按比例調整：例如40毫升全血，試劑用量加倍
• 操作時，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
• 操作時，須戴手套
• 建議使用新鮮全血：2小時內的全血為理想狀態，不要超過24小時
• 全血樣品采集須使用全血樣品采集須使用EDTA二鉀血液抗凝液（ 12059.1）、ACD血液抗凝液（ 12059.4），或肝素鈉血液抗凝液（ 12059.5）
• 建議使用足夠的樣品量
• 血小板提取量因人而異；如果不足，建議增加全血量
• 線粒體操作均須在4℃或以下狀態下進行
• 建議嚴格控制操作時間
• 通常勻化次數為20至40下（或細胞顆粒群消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加勻化次數
• 通常孵育5分鐘（不宜超過5分鐘）達到80％的細胞裂解為理想狀態。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數
• 物理處理法是優先推薦的技術處理
• 通常每毫升全血平均可獲得2 X 10⁸血小板
• 通常10毫升全血的血小板線粒體含量為10至25微克線粒體蛋白
• 可以通過增加線粒體溶解時間（30分鐘）和酶解時間（直至16小時），獲得大量的DNA產量
• 從2.5 X10⁸細胞中提取的線粒體DNA通常達1微克
• 本產品所獲得的線粒體DNA純度和產量zui為理想，確保無核DNA和外源性DNA污染
• 本公司提供系列線粒體試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定無核酶污染
• 本產品經鑒定萃取產量和純化程度高
• 本產品經鑒定無基因組DNA污染