純化線粒體腫脹光度法測定試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

純化線粒體腫脹光度法測定試劑是一種旨在通過光度法檢測線粒體的光散射性變化，即吸光峰值的變化，來實(shí)時(shí)分析和觀察線粒體基質(zhì)容積或線粒體膨脹性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種純化線粒體膨脹程度的定量檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，活體檢測，分辨率高，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

線粒體容積變化是衡量線粒體活性的基本參數(shù)。線粒體應(yīng)對(duì)細(xì)胞對(duì)于藥物、凋亡誘導(dǎo)、細(xì)胞周期變化等反應(yīng)采取的活性變化，包括膜電位、氧消耗、以及膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）功能等的改變。線粒體基質(zhì)容量（mitochondrial matrix volume）成為檢測線粒體活性和功能的指標(biāo)。一旦各種因素包括凋亡刺激、活性氧影響導(dǎo)致線粒體膜通道孔開放或膜電位的消失，而導(dǎo)致線粒體容積增大，即線粒體膨脹（mitochondrial swelling），使線粒體的光散射性（light scattering）降低，通過分光光度儀520nm波長的吸光峰值的變化，定量分析線粒體的膨脹程度。該波長區(qū)域可以避免細(xì)胞色素和蛋白質(zhì)的干擾。  

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A）                       20毫升

膨脹液（Reagent B）                      500微升

產(chǎn)品說明書               1份

保存方式

保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

比色皿96孔板：用于線粒體光度分析的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于線粒體光度定量分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長520nm，間隔30秒測讀1次，持續(xù)10分鐘至30分鐘，并置零

• 樣品膨脹度檢測

• 準(zhǔn)備好待測的純化線粒體樣品：對(duì)照樣品和處理樣品
• 分別移取20微升線粒體樣品（總量為200微克）到比色皿或96孔板的對(duì)應(yīng)孔里
• 分別加入170微升緩沖液（Reagent A），混勻
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀（波長520nm）：獲得0分鐘初始讀數(shù) 
• 動(dòng)態(tài)測讀1分鐘或室溫下靜置1分鐘
• 即刻分別加入10微升膨脹液（Reagent B） 
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀（波長520nm）：動(dòng)態(tài)記錄10分鐘吸光值變化或設(shè)定時(shí)間點(diǎn)記錄實(shí)際吸光值
• 獲得實(shí)際吸光讀數(shù)：0分鐘讀數(shù)-10分鐘吸光讀數(shù)――實(shí)際吸光讀數(shù)高，表明線粒體膨脹度高
• 或構(gòu)建線粒體膨脹-藥物濃度關(guān)系曲線：縱座標(biāo)（Y）為實(shí)際吸光讀數(shù)，橫座標(biāo)（X）為藥物濃度

二、誘導(dǎo)劑篩選檢測

• 準(zhǔn)備好待測的純化線粒體樣品
• 移取20微升線粒體樣品（總量為200微克）到比色皿或96孔板的對(duì)應(yīng)孔里
• 加入170微升緩沖液（Reagent A），混勻
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀（波長520nm）：獲得0分鐘初始讀數(shù) 
• 動(dòng)態(tài)測讀1分鐘或室溫下靜置1分鐘
• 即刻加入10微升用戶自備的待測誘導(dǎo)劑，混勻（注意：可以設(shè)定不同濃度梯度）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀（波長520nm）：動(dòng)態(tài)記錄10分鐘吸光值變化或設(shè)定時(shí)間點(diǎn)記錄實(shí)際吸光值――吸光值降低，表明誘導(dǎo)劑作用增強(qiáng)
• 構(gòu)建線粒體膨脹誘導(dǎo)曲線：縱座標(biāo)（Y）為實(shí)際吸光值 ，橫座標(biāo)（X）為時(shí)間（分鐘）
• 或構(gòu)建線粒體膨脹-誘導(dǎo)劑濃度關(guān)系曲線：縱座標(biāo)（Y）為實(shí)際吸光值，橫座標(biāo)（X）為誘導(dǎo)劑濃度

三、抑制劑篩選檢測

• 準(zhǔn)備好待測的純化線粒體樣品
• 移取20微升線粒體樣品（總量為200微克）到比色皿或96孔酶標(biāo)板的對(duì)應(yīng)孔里
• 加入160微升室溫預(yù)熱的緩沖液（Reagent A），混勻
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀（波長520nm）：獲得0分鐘初始讀數(shù) 
• 動(dòng)態(tài)測讀1分鐘或室溫下靜置1分鐘
• 加入10微升用戶自備的待測抑制劑，混勻（注意：可以設(shè)定不同濃度梯度）
• 動(dòng)態(tài)測讀2分鐘或室溫下靜置2分鐘
• 即刻加入10微升膨脹液（Reagent B），混勻
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀（波長520nm）：動(dòng)態(tài)記錄10分鐘吸光值變化或設(shè)定時(shí)間點(diǎn)記錄實(shí)際吸光值――吸光值不變，表明抑制劑作用增強(qiáng)
• 或構(gòu)建線粒體膨脹-抑制劑濃度關(guān)系曲線：縱座標(biāo)（Y）為實(shí)際吸光值，橫座標(biāo)（X）為抑制劑濃度

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為50次操作
• 本產(chǎn)品用于線粒體膨脹度檢測、以及誘導(dǎo)劑和抑制劑篩選
• 操作時(shí)，須戴手套
• 使用時(shí)，避免污染母液，尤其是緩沖液（Reagent A）
• 線粒體樣品中忌用磷酸鹽、EDTA、鈣鎂離子等處理
• 建議使用未經(jīng)誘導(dǎo)或抑制處理的樣品作為對(duì)照樣品