以下是影響ELISA檢測的關鍵因素，也是眾多ELISA 用戶在實驗中經常遇到的問題及解決方案 ：

Q1：為什么所有試劑和檢測樣本要平衡至室溫后再進行加樣操作？

A1：溫度是ELISA結合反應的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應，實驗前務 必將所有試劑平衡至室溫，包括檢測樣本。避免因溫度的動力學反應差異而導致ELISA檢測結 果的不準確。

Q2：為什么標準曲線線性較差？

A2：按照推薦方式保存標準品；溶解標準品之前需短暫離心，*收集粉末；確保標準品* 溶解和混勻（大約10min），然后再進行后續的系列稀釋步驟，確保每一步都充分混勻且 移液；顯色的恰當終止；選擇合適的數學擬合方程繪制標準曲線。

Q3：ELISA實驗為什么必須設置復孔？

A3：為獲得更準確的實驗結果，強烈建議標準品及樣本進行復孔檢測。 因為復孔檢測可以：

   ★計算平均值，確保實驗結果更準確；

   ★解決實驗中誤操作造成的跳孔現象；

   ★計算CV值，對實驗的操作和試劑盒的精密度進行評估。

Q4：為什么實驗過程中孵育、洗滌需要振蕩？如何振蕩？

A4：振蕩孵育使反應更充分，振蕩洗滌使背景更干凈。建議使用酶標96孔微孔板振蕩器。 孵育過程振蕩，可以加快、加強抗原抗體間的相互碰撞接觸，使得反應過程更加*，OD值通 常會比未振蕩孵育的結果要高；洗滌過程振蕩，可以使洗板更干凈，在很大程度上能降低背景 值，同時可以提高試劑盒檢測的靈敏度。

Q5：何時終止ELISA反應？

A5：ELISA實驗zui終需要酶催化底物顯色反應來完成，在zui合適的時間終止反應是ELISA實驗成 功的重要因素。在HRP-TMB酶反應系統中，當zui高濃度標準品顏色不再變深，倒數2-3個濃度標 準品顏色開始有淺藍色時，便需要終止反應；或者也可以根據zui高濃度標準品孔在620nm的OD 值來決定，OD620=0.9-0.95之間時即可終止。

Q6：為什么酶標儀讀數時必須選用雙波長？

A6：首先，酶標儀使用前務必預熱10-15min，使測讀結果更穩定。其次，ELISA實驗采用雙波 長測定吸光度，可以排除單波長檢測時的測定干擾（標本的濃度，干擾色等）。一般采用zui大 波長作為參照波長，在參照波長下，檢測物的吸光值zui小，檢測波長和參照波長的吸光值之差 可以消除非特異性吸收；因此，雙波長測定，可zui大限度的消除指紋、雜質及不透光的物質對 酶標儀讀數帶來的誤差，以保證實驗數據的準確度。