組織鈣離子濃度熒光定量檢測(cè)試劑盒

說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

組織鈣離子濃度熒光定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)鈣離子特異性熒光探針Fluo-4，與鈣離子結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，在熒光分光光度儀下觀察相對(duì)熒光峰值的變化，來(lái)測(cè)定組織裂解懸液中總鈣離子濃度的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織（動(dòng)物、人體等）裂解萃取樣品中總鈣離子的濃度檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，檢測(cè)敏感。

技術(shù)背景

鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進(jìn)一步分成具有活性的復(fù)合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對(duì)神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運(yùn)輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。鈣的檢測(cè)包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求。Fluo-4，一種與鈣離子結(jié)合，其熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)100倍的熒光探針，可以敏感測(cè)定微量游離鈣離子水平。在熒光分光光度儀下，激發(fā)波長(zhǎng)485nm，散發(fā)波長(zhǎng)520nm，來(lái)定量測(cè)定組織細(xì)胞的鈣濃度。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）      毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

反應(yīng)液（Reagent C）      毫升

飽和液（Reagent D）      毫升

陰性液（Reagent E）      毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)  1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent C）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

酶標(biāo)板：用于樣品熒光測(cè)定的容器

熒光酶標(biāo)儀：用于樣品熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的xx微升裂解液（Reagent B） 
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/span>
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好上述制備的待測(cè)樣品，置于冰槽里備用
• 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（22℃）：激發(fā)波長(zhǎng)485nm，散發(fā)波長(zhǎng)520nm

三、熒光測(cè)定

• 準(zhǔn)備1個(gè)96孔酶標(biāo)板，標(biāo)記為：樣品孔、空白對(duì)照孔、zui大對(duì)照空
• 移取xx微升（20微克蛋白）上述制備的樣品到樣品孔里
• 移取xx微升飽和液（Reagent D）到zui大對(duì)照空里
• 移取xx微升陰性液（Reagent E）到空白對(duì)照空
• 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent C）到所有孔里
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板，混勻
• 室溫下（22℃），孵育30分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測(cè)讀：獲得相對(duì)熒光單位（relative fluorescence unit；RFU） 
• 計(jì)算樣品鈣離子濃度（注意：不要遺忘乘上稀釋倍數(shù)）

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 避免使用EDTA等處理樣品 
• 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 檢測(cè)敏感度可達(dá)納摩爾級(jí)鈣濃度范圍
• 樣品濃度可以按照蛋白量或組織量定義
• 本公司提供系列鈣生化檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感