超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒產品說明書

主要用途

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase；SOD）活性檢測試劑是一種旨在通過比色測定高度可溶性的四唑鹽在超氧化物陰離子的還原作用下產生的水溶性甲臢染料，來定量分析氧化酶的還原效率，由此檢測超氧化物岐化酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞和組織，包括紅細胞或線粒體中超氧化物歧化酶的活性檢測以及50%活性抑制率（IC50）。廣泛運用于醫藥研究、生化分析、植物生理、食品工程等方面。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

超氧化物岐化酶（SOD），是體內的重要金屬酶抗氧化劑，催化超氧化物陰離子發生岐化作用，生成過氧化氫（H2O2）和分子氧（O2），破壞自由基，防止氧毒性。SOD濃度的變化與許多疾病密切相關。檢測超氧化物岐化酶活性的方法包括氮藍四唑（nitroblue tetrazolium；NBT）法，使用和氧化酶來控制超氧化物的生成并檢測超氧自由基的NBT的比率，其敏感度較高。但是NBT的還原終產物雙甲臢染料水溶性差，易和還原的氧化酶相互作用。還原法通過還原后的生成紫色的染料，來檢測超氧自由基。但是還原后的的吸收峰過窄而敏感性差，并且受到與反應的細胞提取物，例如NADPH還原酶或其他的還原劑干擾，造成背景噪音高，而無法測定低水平的SOD活性。 

超氧化物歧化酶活性檢測試劑使用高度水溶性的四唑鹽:WST-1[（2-（4-Iodophenyl）-3- （4-nitrophenyl）-5-（2,4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium，monosodium salt）；2-(4–碘苯基)-3-（4–硝基苯基）-5-（2,4-苯二磺酸）-2H-四唑單鈉鹽]。WST-1靈敏度高，氧化態的吸光度低，呈淺黃色，水溶性好，可以100%被SOD抑制，檢測不受pH影響，背景噪音低。WST-1被O2^－還原（呈現深黃色）的還原率和氧化酶的活性成線性關系，該反應能被超氧化物岐化酶（SOD）抑制（抑制，WST-1呈現無色）。利用SOD能抑制WST-1和O2^－的氧化還原能力來測定SOD的活性（波長為450nm的比色分析）。

產品內容

反應液（Reagent A）               15毫升

染色液（Reagent B）                    75微升

催化液（Reagent C）                    40微升

稀釋液（Reagent D）                     2毫升

補充液（Reagent E）                1.5毫升

標準液（Reagent F）                100微升

產品說明書                  1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent B），避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于反應液配制的容器

15毫升錐形離心管：用于反應液配制的容器

酶標板或比色皿：用于比色分析的容器

酶標儀或分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化，然后移出4毫升反應液（Reagent A）到新的15毫升錐形離心管，加入20微升染色液（Reagent B），輕柔混勻后，置于暗室里，標記為染色工作液。然后移出400微升稀釋液（Reagent D）到新的1.5毫升離心管，加入10微升催化液（Reagent C），輕柔混勻后，置于冰槽里，標記為催化工作液。然后進行下列操作。

一、 標準樣品制備

1. 取出待測的標準液（Reagent F），置于冰槽里

2. 準備1個96孔酶標板，做好1至5號標記，置于冰槽里

3. 按下列順序依次加入下列反應液到96孔板的標記孔里：

1） 分別移取20微升稀釋液（Reagent D）到96孔板的2至5號孔里

2） 移取40微升標準液（Reagent F）到96孔板的1號孔里

3） 用200微升槍頭抽去20微升1號孔里的標準液（Reagent F）到96孔板的2號孔里

4） 用200微升槍頭上下抽吸混勻2號孔

5） 用200微升槍頭抽去20微升2號孔里含有標準液（Reagent F）的稀釋液到96孔板的3號孔里

6） 用200微升槍頭上下抽吸混勻3號孔

7） 用200微升槍頭抽去20微升3號孔里含有標準液（Reagent F）的稀釋液到96孔板的4號孔里

8） 用200微升槍頭抽去20微升4號孔里含有標準液（Reagent F）的稀釋液，扔掉

9） SOD實際濃度見下表

二、 樣品測定

1． 準備好待測的樣品（例如細胞或組織勻漿上清液包括紅細胞以及胞漿SOD樣品或線粒體SOD樣品等）和上述制備的標準樣品，置于冰槽里

2． 設定好酶標儀并預熱：波長450nm

3． 準備好1個96孔板，做好相應標記：樣品背景、零活性對照、活性對照、待測樣品和標準樣品

4． 按下表依次加入下列試劑到96孔板的相應孔里：

A． 分別移取200微升含有反應液（Reagent A）和染色液（Reagent B）的染色工作液到96孔板的所有孔里

B． 然后分別移取20微升含有催化液（Reagent C）和稀釋液（Reagent D）的催化工作液到96孔板的相應孔里

C． 繼續分別移取20微升稀釋液（Reagent D） 到96孔板的相應孔里

D． 繼續分別移取20微升補充液（Reagent E） 到96孔板的相應孔里

E． 移取20微升待測樣品到96孔板的相應孔里（注意：參見注意事項6）

F． 最后分別移取上述制備的20微升不同濃度的標準液（Reagent F）到96孔板的相應孔里

5． 輕輕搖動96孔板，混勻反應液

6． 放進37℃培養箱孵育20分鐘，避免光照

7． 即刻放進酶標儀檢測，波長為450nm

8． 計算樣品SOD活性（SOD活性＝XO即氧化酶抑制百分率）：

1）[（活性讀數－零活性讀數）－（樣品活性讀數－樣本背景讀數）]÷（活性讀數－零活性

讀數）＝實際抑制百分率

2）IC50：50％抑制率所需的樣品SOD或樣品含有SOD蛋白濃度（毫克/毫升）

  X（所需樣品蛋白濃度）＝（已知樣品蛋白濃度÷實際抑制百分率）X 50％

3）樣品SOD實際活性單位計算：

A． 構建SOD標準曲線：橫座標（x軸）為每毫升SOD單位濃度；縱坐標（y軸）為標準樣品讀數（吸光單位OD值）

B． 根據SOD標準曲線，測算樣品中含有SOD或SOD類物質的活性單位（單位/毫克樣品）

C． 根據樣品50％抑制百分率，找到對應SOD活性單位（單位/毫克樣品）

注意事項

1． 本產品為50次操作

2． 操作時，須戴手套

3． 操作時，須在4℃下進行

4． 染色液（Reagent B）為淺黃色，如果有結晶析出，放進37℃溫育數分鐘即可。染色液（Reagent B）一旦被還原，呈現可見黃色或深黃色；如果含有SOD，則會呈現為無色

5． 每增加10個樣品，增加染色工作液為：反應液（Reagent B）2毫升＋染色液（Reagent B）10微升，和催化工作液為：稀釋液（Reagent D）200微升＋催化液（Reagent C）5微升，以此類推。配制工作液時，須根據樣本數量配制實際工作液容量

6． 待測樣品總量通常為20至200微克的細胞裂解懸液或2至20微克線粒體裂解懸液

7． 測定20個以上樣品，建議使用排槍操作，以減少樣品操作時間上的延長導致超氧化物（superoxide）的釋放而干擾精確測定

8． 孵育時，避免光照

9． 孵育后即刻比色測定

10． 建議每個樣品檢測重復3次

11． 0.1毫摩爾抗壞血酸（Ascorbic acid）、5毫摩爾還原型（Glutathione）和牛血清白蛋白會增加背景讀數，干擾樣品測定，但不影響實際活性檢測（已有背景讀數調整）

12． 樣品SOD實際活性單位定義：每毫克樣品蛋白含有X微克或X單位SOD量

13． 標準液（Reagent F）的活性單位定義為25℃溫度，pH7.8的條件下，抑制50%在氧化酶參與的反應系統中，WST-1和O2^－之間的氧化還原能力

14． 本公司提供系列超氧化物歧化酶分析試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測敏感