HL50082.3 v.A

組蛋白脫乙酰化酶2（HDAC2）活性比色法定量檢測試劑盒

主要用途

組蛋白脫乙?；?/span>2（HDAC2）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過比色探針對硝基苯胺標記乙?；嚯牡孜铮?/span>特異性抑制劑的存在下，經過HDAC脫乙酰基后，被位點特異性氨基肽酶水解，釋放黃色對硝基苯胺，即采用比色法來測定樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞、組織裂解萃取液樣品（動物、人體）、核蛋白樣品、部分或純化酶樣品中HDAC2的特異活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

人體組蛋白脫乙?；福?/span>histone deacetylase；HDAC）家屬分成三類共20多個蛋白：種類I（class I）與酵母Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于細胞核中；種類II（class II）與酵母Hda1蛋白同源，包括HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于細胞核和細胞漿里；上述兩大種類的蛋白分子催化結構域含有鋅，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。種類III（class III）為NAD輔助因子必需，又稱為sirtuins，與酵母Sir2同源，包括SIRT1至7等。其曲古菌素A（trichostatin A；TSA）不敏感。通過催化組蛋白上賴氨酸殘基ε氨基酸的乙?；鶊F的水解脫離，改變核小體（nucleosome）結構達到調節基因表達，從而調節細胞周期和分化，一旦失控，則會導致腫瘤和衰老。HDAC2（EC3.5.1.98），與各種不同蛋白，包括YY1，形成轉錄抑制復合物，達到轉錄調節、細胞周期進程、以及發育變化等控制作用。其脫乙酰化目標序列為 XXXLys（Ac）X。基于乙?；嚯木哂锌拱被拿盖须x的功能，首先通過比色染料對硝基苯胺（p-Nitroaniline；p-NA）來標記乙酰化多肽底物，其次，在特異性抑制劑apicidin的差異濃度作用下，進行HDAC的脫乙酰化，最后底物進一步在氨基肽酶的催化酶解，釋放出具有強烈吸光值的黃色對硝基苯胺（波長405nm），由此來定量測定組蛋白脫乙?；?/span>2的特異活性。其反應系統為：

產品內容

緩沖液（Reagent A）                      毫升

底物液（Reagent B）                      微升

終止液（Reagent C）                      微升

酶解液（Reagent D）                      微升

補充液（Reagent E）                      微升

專性液（Reagent F）                      微升

產品說明書              1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，底物液（Reagent B）避免光照，有效保證6月

用戶自備

（微型）臺式離心機：用于細胞預處理

培養箱：用于反應物孵育

酶標板或比色皿：用于反應和比色的容器

酶標儀或分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、 測定準備

1． 準備好待測樣品（例如核蛋白或純化酶樣品等），置于冰槽里

2． 設定好酶標儀或分光光度儀（溫度為37℃）： 波長405nm，并置零

二、活性測定

1） 總活性測定

1． 在96孔酶標板上做好相應標記：背景空對照和待測樣品總活性

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent A）到相應孔中

3． 分別加入xx微升底物液（Reagent B）

4． 分別加入xx微升補充液（Reagent E）或待測樣品（50微克核蛋白或200微克細胞裂解萃取液總蛋白）（注意：樣品須清澈）

5． 輕輕搖動96孔酶標板30秒

6． 放進37℃培養箱里，孵育60分鐘，避免光照

7． 分別加入xx微升終止液（Reagent C）

8． 分別加入xx微升酶解液（Reagent D）

9． 輕輕搖動96孔酶標板30秒

10． 在37℃培養箱里，孵育30分鐘

11． 即刻放進酶標儀或轉移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測：獲得吸光讀數

2） 非特異活性測定

1． 在96孔酶標板上做好相應標記：待測樣品非特異活性

2． 移取xx微升緩沖液（Reagent A）到相應孔中

3． 加入xx微升專性液（Reagent F）

4． 加入20微升待測樣品（50微克核蛋白或200微克細胞裂解萃取液總蛋白）（注意：樣品須清澈）

5． 放進37℃培養箱里，孵育10分鐘，避免光照

6． 加入xx微升底物液（Reagent B）

7． 輕輕搖動96孔酶標板30秒

8． 放進37℃培養箱里，孵育60分鐘，避免光照

9． 加入xx微升終止液（Reagent C）

10． 加入xx微升酶解液（Reagent D）

11． 輕輕搖動96孔酶標板30秒

12． 在37℃培養箱里，孵育30分鐘

13． 即刻放進酶標儀或轉移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測：獲得吸光讀數

3） 樣品活性計算

  （3）樣品特異活性

樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性

注意事項

1． 本產品為20次操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，背景測定只需1次

4． 樣品須澄清，至關重要

5． 樣品處理時，避免使用蛋白酶抑制劑、PMSF、烷基胺（alkyl amine）等

6． 孵育反應完成后即刻進行比色測定

7． 濾波器可以使用波長400nm替代405nm

8． 測定值由低到高變化；測定可以持續60分鐘

9． 測定值吸光讀數越高，表明酶活性越高

10． 比色測定后，比色皿須清洗

11． 待測樣本為核蛋白樣品，其蛋白濃度為50微克/20微升；待測樣本為細胞裂解懸液，其蛋白濃度為200微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒HL30030.1）

12． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

13． 組蛋白脫乙酰基酶2單位活性定義為：在37℃，pH 8.0條件下，每分鐘內能夠釋放1微摩爾對硝基所需的酶量作為一個活性單位

14． 本公司提供系列組蛋白脫乙酰基酶檢測試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測敏感