4 肉類食品中致病性微生物的檢測(cè)技術(shù)

  解決肉類食品安全問(wèn)題不但可以預(yù)防與控制食源性疾病的發(fā)生和傳播，還可以避免貿(mào)易擴(kuò)大食源性疾病的流行，同時(shí)也是為了更好的解決世界貿(mào)易中存在的技術(shù)壁壘。為確保肉類食品安全與貿(mào)易，需要大力加強(qiáng)肉類食品檢驗(yàn)的力度，建立、健全肉類食品法規(guī)，加強(qiáng)食品安全監(jiān)控，提高檢測(cè)技術(shù)，特別是肉類食品微生物的快速檢測(cè)技術(shù)。

4．1 傳統(tǒng)檢測(cè)方法

  食源性致病菌的常規(guī)檢測(cè)流程為：標(biāo)本一選擇性增菌一選擇性增菌一挑單個(gè)可疑菌落一分離培養(yǎng)一常規(guī)細(xì)菌生化鑒定／血清學(xué)試驗(yàn)／毒素鑒定一檢驗(yàn)報(bào)告。顯然，這種方法存在周期長(zhǎng)(5—6d)、操作繁瑣、準(zhǔn)確性低、工作量大等缺點(diǎn) J。

4．2 免疫學(xué)方法

  免疫擴(kuò)散法是zui先利用的免疫學(xué)方法檢．壩0致病微生物的，它主要分為單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)和雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，它們檢出靈敏度較低，檢測(cè)標(biāo)本需要濃縮，操作量大，因而未能推廣。放射免疫法(RIA)的應(yīng)用將同位素測(cè)定的高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的高特異性有效地結(jié)合在一起， 使得其檢測(cè)的靈敏度和特異性均有所提高而且具有簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)。RIAN~]定食品標(biāo)本不需要濃縮，1～2d之內(nèi)可出結(jié)果。但該方法存在放射性污染和需要專門的防護(hù)設(shè)備、檢測(cè)儀器等問(wèn)題， 也不易推廣 。

  免疫熒光技術(shù)(IFT)是在將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上，與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)特異性的熒光反應(yīng)，可用來(lái)對(duì)葡萄球菌、大腸桿菌Ol57：H7、沙門氏菌和單核增生李斯特菌等進(jìn)行快速檢測(cè)。王軍等建立了養(yǎng)殖大黃魚(yú)病原溶藻弧菌的間接熒光抗體免疫快速檢測(cè)方法，此方法的主要特點(diǎn)特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。

  酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)方法是一種敏感、快速、簡(jiǎn)單的方法，應(yīng)用較廣。ELISA法是將酶分子與抗體分子結(jié)合形成酶標(biāo)記分子。當(dāng)它與固相免疫吸附劑中相應(yīng)的抗原或抗體、或抗原抗體結(jié)合物相遇時(shí)形成酶抗原抗體結(jié)合物，加入酶底物，結(jié)合物中的酶水解底物，生成有色的反應(yīng)物，根據(jù)顏色的深淺，進(jìn)行檢測(cè)。它結(jié)合了免疫熒光法和放射免疫測(cè)定法兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有可定量、反應(yīng)靈敏準(zhǔn)確、標(biāo)記物穩(wěn)定、適用范圍寬、結(jié)果判斷客觀、簡(jiǎn)便*、檢測(cè)速度快以及費(fèi)用低等特點(diǎn)，且同時(shí)可進(jìn)行上千份樣品的分析。Kryinskiand等將ELISA用于食品中沙門氏菌的檢測(cè)，并在應(yīng)用中不斷得以發(fā)展，8O年代Padhye~91克隆抗體的ELISA檢測(cè)大腸桿菌0157：H7，其操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確。Mansfield等 。。將免疫磁珠分離技術(shù)與ELISA聯(lián)合起來(lái)建立一個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)對(duì)生雞肉和飼料的檢測(cè)限為2×103cfu／25g。由于ELISA對(duì)試劑的選擇性高，很難同時(shí)分析多種成分；同時(shí)對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng)，分析分子量很小的化合物或很不穩(wěn)定的化合物有一定的困難。

  免疫印跡法是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。免疫印跡法具有分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種zui常用的方法，如組織抗原的定性定量檢測(cè)、多肽分子的質(zhì)量測(cè)定及病毒的抗體或抗原檢測(cè)等。Order[m建立的免疫印跡技術(shù)檢測(cè)食品提取物中的*的腸毒素，通過(guò)電泳使分子量大于腸毒素的葡萄球菌蛋白A與腸毒素分開(kāi)，從而免除了葡萄球菌蛋白A的影響。

4．3 基因芯片技術(shù)

  基因芯片技術(shù)是上個(gè)世紀(jì)末誕生的一項(xiàng)新型生物技術(shù)。它是將各種基因寡核苷酸點(diǎn)樣于芯片表面，微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后制備熒光標(biāo)記探針，然后再與芯片上寡核苷酸點(diǎn)雜交，zui后通過(guò)掃描儀定量和分析熒光分布模式來(lái)確定檢測(cè)樣品是否存在某些特異微生物。基因芯片技術(shù)理論上可以在一次實(shí)驗(yàn)中檢出所有潛在的致病菌，也可以用同一張芯片檢測(cè)某一致病原的各種遺傳學(xué)指標(biāo)，檢測(cè)的靈敏度、特異性和快速便捷性都很高，因而在致病原分析檢測(cè)中有很好的發(fā)展前景。周巍” 用不對(duì)稱PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)建立了一種準(zhǔn)確、快速和高敏感性的檢測(cè)肉中常見(jiàn)食源性致病菌的方法。Wilson 采用病原體診斷基因和20寡核苷酸藻紅素標(biāo)記探針開(kāi)發(fā)出一套多病原體識(shí)別的微陣列，可準(zhǔn)確識(shí)別1 8種致病性病毒、原核生物和真核生物．

4．4 核酸探針技術(shù)

  核酸探針檢測(cè)技術(shù)的依據(jù)是核酸雜交，其工作原理是兩條堿基互補(bǔ)的DNA鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下可以按堿基配對(duì)原則，形成雜交DNA分子。已知每個(gè)生物的各種性質(zhì)和特征都是由其所含的遺傳基因所決定。通過(guò)將微生物的特征基因的一條DNA鏈進(jìn)行標(biāo)記，即可制成DNA探針。Petrone “ 】以LM以hly and inla毒力基因特異的互補(bǔ)序列為探針，雜交檢測(cè)不同樣品來(lái)源的李斯特菌，取得了較為理想的結(jié)果。

4．5 多重PCR技術(shù)

  多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型PCR擴(kuò)增技術(shù)，是在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增多條目的DNA片斷，采用這一技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)多種病原微生物。其由于具有性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性等特點(diǎn)，而在食品檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用能同時(shí)檢測(cè)多種病原菌的檢測(cè)。Kawasaki 則應(yīng)用多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)肉類中

的沙門氏菌、李斯特菌和大腸桿菌Ol57：H7，以通用預(yù)增菌肉湯(universal preenrichmentbrothUPB)作*， 通過(guò)增菌后檢測(cè)敏感性可以達(dá)到40cfu／kg。

4．6 生物傳感技術(shù)

  生物傳感技術(shù)主要是由生物工程和各種技術(shù)學(xué)科的相互滲透發(fā)展起來(lái)的。目前，用于食品毒素檢測(cè)的生物傳感器主要為光學(xué)生物傳感器，特別是表面等離子激元共振(surface plasmon resonance，SPR)生物傳感器的應(yīng)用。SPR是利用表面等離子激元共振現(xiàn)象和SRP譜峰對(duì)金屬表面上電解質(zhì)變化敏感的特點(diǎn)，通過(guò)將受體固定在金屬膜上，檢測(cè)其與液相配體的特異性結(jié)合。SRP作為一種檢測(cè)方法，以其使用簡(jiǎn)單和快速的特點(diǎn)在食品安全領(lǐng)域廣泛使用。SRP檢測(cè)的缺陷是只能同時(shí)分析幾種物質(zhì)(少于四種)：不能區(qū)分特異的靶物質(zhì)和芯片表面其他樣本的非特異交叉反應(yīng)物：對(duì)于固定的受體，當(dāng)其發(fā)生點(diǎn)突變、化學(xué)改變或功能活性改變時(shí)，SRP不能將其同完整的分析物加以區(qū)分。Homola“ 等應(yīng)用表面質(zhì)粒共振生物傳感器(SPR)檢測(cè)肉類食品中的*腸毒素，并可達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)控的目的。

5 展望

  肉類食品放心工程關(guān)系到人民群眾的切身利益和社會(huì)安定，關(guān)系到肉類食品行業(yè)的健康發(fā)展。肉類安全將繼續(xù)面臨著微生物的危害及相關(guān)問(wèn)題的挑戰(zhàn)。我們必須認(rèn)識(shí)到肉類食品安全是靠生產(chǎn)者、加工人員、零售商、消費(fèi)者共同努力來(lái)完成的。利用*充分了解肉類常見(jiàn)微生物的特性，嚴(yán)格控制致病微生物的危害，確保肉類食品的安全。