4 肉類食品中致病性微生物的檢測技術(shù)

  解決肉類食品安全問題不但可以預(yù)防與控制食源性疾病的發(fā)生和傳播，還可以避免貿(mào)易擴大食源性疾病的流行，同時也是為了更好的解決世界貿(mào)易中存在的技術(shù)壁壘。為確保肉類食品安全與貿(mào)易，需要大力加強肉類食品檢驗的力度，建立、健全肉類食品法規(guī)，加強食品安全監(jiān)控，提高檢測技術(shù)，特別是肉類食品微生物的快速檢測技術(shù)。

4．1 傳統(tǒng)檢測方法

  食源性致病菌的常規(guī)檢測流程為：標本一選擇性增菌一選擇性增菌一挑單個可疑菌落一分離培養(yǎng)一常規(guī)細菌生化鑒定／血清學(xué)試驗／毒素鑒定一檢驗報告。顯然，這種方法存在周期長(5—6d)、操作繁瑣、準確性低、工作量大等缺點 J。

4．2 免疫學(xué)方法

  免疫擴散法是zui先利用的免疫學(xué)方法檢．壩0致病微生物的，它主要分為單向免疫擴散試驗和雙向免疫擴散試驗，它們檢出靈敏度較低，檢測標本需要濃縮，操作量大，因而未能推廣。放射免疫法(RIA)的應(yīng)用將同位素測定的高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的高特異性有效地結(jié)合在一起， 使得其檢測的靈敏度和特異性均有所提高而且具有簡單、快速的特點。RIAN~]定食品標本不需要濃縮，1～2d之內(nèi)可出結(jié)果。但該方法存在放射性污染和需要專門的防護設(shè)備、檢測儀器等問題， 也不易推廣 。

  免疫熒光技術(shù)(IFT)是在將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體(或抗原)上，與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)特異性的熒光反應(yīng)，可用來對葡萄球菌、大腸桿菌Ol57：H7、沙門氏菌和單核增生李斯特菌等進行快速檢測。王軍等建立了養(yǎng)殖大黃魚病原溶藻弧菌的間接熒光抗體免疫快速檢測方法，此方法的主要特點特異性強、敏感性高、速度快。

  酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)方法是一種敏感、快速、簡單的方法，應(yīng)用較廣。ELISA法是將酶分子與抗體分子結(jié)合形成酶標記分子。當(dāng)它與固相免疫吸附劑中相應(yīng)的抗原或抗體、或抗原抗體結(jié)合物相遇時形成酶抗原抗體結(jié)合物，加入酶底物，結(jié)合物中的酶水解底物，生成有色的反應(yīng)物，根據(jù)顏色的深淺，進行檢測。它結(jié)合了免疫熒光法和放射免疫測定法兩種技術(shù)的優(yōu)點，具有可定量、反應(yīng)靈敏準確、標記物穩(wěn)定、適用范圍寬、結(jié)果判斷客觀、簡便*、檢測速度快以及費用低等特點，且同時可進行上千份樣品的分析。Kryinskiand等將ELISA用于食品中沙門氏菌的檢測，并在應(yīng)用中不斷得以發(fā)展，8O年代Padhye~91克隆抗體的ELISA檢測大腸桿菌0157：H7，其操作簡便、快速、準確。Mansfield等 。。將免疫磁珠分離技術(shù)與ELISA聯(lián)合起來建立一個檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)對生雞肉和飼料的檢測限為2×103cfu／25g。由于ELISA對試劑的選擇性高，很難同時分析多種成分；同時對結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng)，分析分子量很小的化合物或很不穩(wěn)定的化合物有一定的困難。

  免疫印跡法是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。免疫印跡法具有分析容量大、敏感度高、特異性強等優(yōu)點，是檢測蛋白質(zhì)特性、表達與分布的一種zui常用的方法，如組織抗原的定性定量檢測、多肽分子的質(zhì)量測定及病毒的抗體或抗原檢測等。Order[m建立的免疫印跡技術(shù)檢測食品提取物中的*的腸毒素，通過電泳使分子量大于腸毒素的葡萄球菌蛋白A與腸毒素分開，從而免除了葡萄球菌蛋白A的影響。

4．3 基因芯片技術(shù)

  基因芯片技術(shù)是上個世紀末誕生的一項新型生物技術(shù)。它是將各種基因寡核苷酸點樣于芯片表面，微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴增后制備熒光標記探針，然后再與芯片上寡核苷酸點雜交，zui后通過掃描儀定量和分析熒光分布模式來確定檢測樣品是否存在某些特異微生物。基因芯片技術(shù)理論上可以在一次實驗中檢出所有潛在的致病菌，也可以用同一張芯片檢測某一致病原的各種遺傳學(xué)指標，檢測的靈敏度、特異性和快速便捷性都很高，因而在致病原分析檢測中有很好的發(fā)展前景。周巍” 用不對稱PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)建立了一種準確、快速和高敏感性的檢測肉中常見食源性致病菌的方法。Wilson 采用病原體診斷基因和20寡核苷酸藻紅素標記探針開發(fā)出一套多病原體識別的微陣列，可準確識別1 8種致病性病毒、原核生物和真核生物．

4．4 核酸探針技術(shù)

  核酸探針檢測技術(shù)的依據(jù)是核酸雜交，其工作原理是兩條堿基互補的DNA鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下可以按堿基配對原則，形成雜交DNA分子。已知每個生物的各種性質(zhì)和特征都是由其所含的遺傳基因所決定。通過將微生物的特征基因的一條DNA鏈進行標記，即可制成DNA探針。Petrone “ 】以LM以hly and inla毒力基因特異的互補序列為探針，雜交檢測不同樣品來源的李斯特菌，取得了較為理想的結(jié)果。

4．5 多重PCR技術(shù)

  多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型PCR擴增技術(shù)，是在同一反應(yīng)體系中加入多對引物同時擴增多條目的DNA片斷，采用這一技術(shù)可同時檢測多種病原微生物。其由于具有性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟簡便性等特點，而在食品檢測中得到廣泛應(yīng)用能同時檢測多種病原菌的檢測。Kawasaki 則應(yīng)用多重PCR技術(shù)同時檢測肉類中

的沙門氏菌、李斯特菌和大腸桿菌Ol57：H7，以通用預(yù)增菌肉湯(universal preenrichmentbrothUPB)作*， 通過增菌后檢測敏感性可以達到40cfu／kg。

4．6 生物傳感技術(shù)

  生物傳感技術(shù)主要是由生物工程和各種技術(shù)學(xué)科的相互滲透發(fā)展起來的。目前，用于食品毒素檢測的生物傳感器主要為光學(xué)生物傳感器，特別是表面等離子激元共振(surface plasmon resonance，SPR)生物傳感器的應(yīng)用。SPR是利用表面等離子激元共振現(xiàn)象和SRP譜峰對金屬表面上電解質(zhì)變化敏感的特點，通過將受體固定在金屬膜上，檢測其與液相配體的特異性結(jié)合。SRP作為一種檢測方法，以其使用簡單和快速的特點在食品安全領(lǐng)域廣泛使用。SRP檢測的缺陷是只能同時分析幾種物質(zhì)(少于四種)：不能區(qū)分特異的靶物質(zhì)和芯片表面其他樣本的非特異交叉反應(yīng)物：對于固定的受體，當(dāng)其發(fā)生點突變、化學(xué)改變或功能活性改變時，SRP不能將其同完整的分析物加以區(qū)分。Homola“ 等應(yīng)用表面質(zhì)粒共振生物傳感器(SPR)檢測肉類食品中的*腸毒素，并可達到實時監(jiān)控的目的。

5 展望

  肉類食品放心工程關(guān)系到人民群眾的切身利益和社會安定，關(guān)系到肉類食品行業(yè)的健康發(fā)展。肉類安全將繼續(xù)面臨著微生物的危害及相關(guān)問題的挑戰(zhàn)。我們必須認識到肉類食品安全是靠生產(chǎn)者、加工人員、零售商、消費者共同努力來完成的。利用*充分了解肉類常見微生物的特性，嚴格控制致病微生物的危害，確保肉類食品的安全。