如果有人告訴你用顯微鏡實(shí)時(shí)觀測(cè)單分子DNA聚合酶復(fù)制DNA，并用它來(lái)測(cè)序，你一定會(huì)認(rèn)為他異想天開(kāi)，沒(méi)有一點(diǎn)生物的sense。

我zui初就是這樣認(rèn)為的，然而它不僅可以實(shí)現(xiàn)，而且已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了！這個(gè)就是被稱(chēng)為第三代的測(cè)序技術(shù)，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time （SMRT™） DNA Sequencing”（單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序）。

我有幸在NIH聽(tīng)到了這個(gè)技術(shù)發(fā)明人Stephen Turner博士的講座，根據(jù)自己粗淺的理解記錄整理一下。

要實(shí)現(xiàn)單分子實(shí)時(shí)測(cè)序，有三個(gè)關(guān)鍵的技術(shù)。

*個(gè)是熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸。顯微鏡現(xiàn)在再厲害，也不可能真的實(shí)時(shí)看到“單分子”。但是它可以實(shí)時(shí)記錄熒光的強(qiáng)度變化。當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入 DNA鏈的時(shí)候，它的熒光就同時(shí)能在DNA鏈上探測(cè)到。當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時(shí)候，它的熒光基團(tuán)就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸不會(huì)影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈*一樣。

第二個(gè)是納米微孔。因?yàn)樵陲@微鏡實(shí)時(shí)記錄DNA鏈上的熒光的時(shí)候，DNA鏈周?chē)谋姸嗟臒晒鈽?biāo)記的脫氧核苷酸形成了非常強(qiáng)大的熒光背景。這種強(qiáng)大的熒光背景使單分子的熒光探測(cè)成為不可能。Pacific Biosciences公司發(fā)明了一種直徑只有幾十納米的納米孔[zero-mode waveguides （ZMWs）]，單分子的DNA聚合酶被固定在這個(gè)孔內(nèi)。在這么小的孔內(nèi)，DNA鏈周?chē)臒晒鈽?biāo)記的脫氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G這四種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸非常快速地從外面進(jìn)入到孔內(nèi)又出去，它們形成了非常穩(wěn)定的背景熒光信號(hào)。而當(dāng)某一種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入到DNA鏈時(shí)，這種特定顏色的熒光會(huì)持續(xù)一小段時(shí)間，直到新的化學(xué)鍵形成，熒光基團(tuán)被DNA聚合酶切除為止（見(jiàn)圖）。
 

第三個(gè)是共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)地快速地對(duì)集成在板上的無(wú)數(shù)的納米小孔同時(shí)進(jìn)行記錄。由于我對(duì)顯微原理的物理知識(shí)匱乏，而Pacific Biosciences公司又沒(méi)有非常強(qiáng)調(diào)在這方面的發(fā)明，不做進(jìn)一步探討。

他們還對(duì)這一技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。

*個(gè)是把雙鏈DNA環(huán)化反復(fù)測(cè)序。人們可以在雙鏈DNA的兩頭連上發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA adaptor，從而使DNA環(huán)化。而DNA聚合酶就能夠以環(huán)化的DNA作為模板滾環(huán)復(fù)制，反復(fù)測(cè)一段DNA序列。這種反復(fù)測(cè)序，糾正了偶爾出現(xiàn)的復(fù)制錯(cuò)誤，從而使測(cè)序精度非常高。

第二個(gè)是激發(fā)光中斷測(cè)序法。DNA聚合酶雖然很穩(wěn)定，但是在強(qiáng)大的激發(fā)光作用下酶也是有一定壽命的。如果把激發(fā)光中斷一段時(shí)間，在這段時(shí)間內(nèi)DNA聚合酶繼續(xù)復(fù)制DNA，當(dāng)激發(fā)光重新開(kāi)啟以后，人們就可以測(cè)到長(zhǎng)DNA鏈后面的序列。

第三代測(cè)序技術(shù)非常可怕。1、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測(cè)10個(gè)堿基，測(cè)序速度是化學(xué)法測(cè)序的2萬(wàn)倍。2、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的processivity（延續(xù)性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很長(zhǎng)的片段），一個(gè)反應(yīng)就可以測(cè)非常長(zhǎng)的序列。 二代測(cè)序現(xiàn)在可以測(cè)到上百個(gè)堿基，但是三代測(cè)序現(xiàn)在就可以測(cè)幾千個(gè)堿基。這為基因組的重復(fù)序列的拼接提供了非常好的條件。3、它的精度非常高，達(dá)到 99.9999%。

此外，它還有兩個(gè)應(yīng)用是二代測(cè)序所不具備的。

*個(gè)是直接測(cè)RNA的序列。既然DNA聚合酶能夠?qū)崟r(shí)觀測(cè)，那么以RNA為模板復(fù)制DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以。RNA的直接測(cè)序，將大大降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。

第二個(gè)是直接測(cè)甲基化的DNA序列。實(shí)際上DNA聚合酶復(fù)制A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時(shí)間不同。根據(jù)這個(gè)不同的時(shí)間，可以判斷模板的C是否甲基化。

Pacific Biosciences公司預(yù)計(jì)2010年或者2011年就會(huì)推出商業(yè)化的測(cè)序儀器。在不遠(yuǎn)的將來(lái)，如果他們能和二代測(cè)序一樣集成100萬(wàn)個(gè)納米微孔，那么一臺(tái)儀器15分鐘就能夠準(zhǔn)確地測(cè)出一個(gè)人的基因組。以后每個(gè)人的基因組測(cè)序成本將變成100美元，人人都可以消費(fèi)得起。想想人類(lèi)基因組計(jì)劃耗資30億美元，費(fèi)時(shí)十幾年，無(wú)數(shù)科學(xué)家參與其中，技術(shù)的革新意義是多么重大啊！

介紹完三代測(cè)序技術(shù)之后，請(qǐng)?jiān)试S我販賣(mài)點(diǎn)私貨：

1、創(chuàng)新創(chuàng)新再創(chuàng)新。國(guó)內(nèi)多數(shù)導(dǎo)師為了掩飾自己idea的匱乏，極力壓制學(xué)生的冒險(xiǎn)欲望，鼓勵(lì)學(xué)生對(duì)一個(gè)小的問(wèn)題花無(wú)數(shù)的時(shí)間用data堆成文章。其實(shí)想做真正有挑戰(zhàn)性的課題的想法是非常可貴的，導(dǎo)師一個(gè)很重要的功能是幫助學(xué)生評(píng)估他們想法的可行性，在可行的情況下盡量提供條件讓他們自己去闖。從想做真正科研的學(xué)生的角度來(lái)說(shuō)，讓那些不能激動(dòng)你的保險(xiǎn)課題見(jiàn)鬼去吧，花大力氣去尋找一些真正能貢獻(xiàn)科學(xué)，貢獻(xiàn)社會(huì)的課題，不要害怕一時(shí)的挫折，這是科研的真意！

2、不要鄙視公司。有很多人以為學(xué)院派的科研是的，其實(shí)真正推動(dòng)科學(xué)進(jìn)步的絕不僅僅是發(fā)生在學(xué)校和研究所的科研。公司同樣能做非常令人暈眩的研究，經(jīng)濟(jì)意義，社會(huì)效益有時(shí)候恐怕遠(yuǎn)甚于學(xué)院派研究。美國(guó)的許多應(yīng)用研究就是在公司里面完成的。

3、學(xué)科交叉。緊咬你的可貴想法，然后橫跨各個(gè)學(xué)科，自己學(xué)或者尋合作者。光是生物背景，想要發(fā)明第三代測(cè)序技術(shù)，那就是個(gè)笑話。