一、免疫組化（Immunohistochemistry,IHC/ Immunocytochemistry, ICC）原理

免疫組化是應用免疫學基本原理--抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素） 顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術（Immunohistochemistry）或免疫細胞化學技術（Immunocytochemistry）。

*，抗體與抗原之間的結合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性，即先將組織或細胞中的某些化學物質提取出來，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實驗動物，制備特異性抗體，再用這種抗體（*抗體）作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過氧化物酶）或*等處理后再與前述抗原成分結合，將抗原放大，由于抗體與抗原結合后形成的免疫復合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學方法將抗原抗體反應部位顯示出來（常用顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒）。通過抗原抗體反應及呈色反應，顯示細胞或組織中的化學成分，在顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應產物，從而能夠在細胞或組織原位確定某些化學成分的分布、含量。組織或細胞中凡是能作抗原或半抗原的物質，如蛋白質、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應的特異性抗體進行檢測。

免疫組織化學技術按照標記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。

用于病理診斷的主要有免疫熒光法和免疫酶法。免疫熒光法是現代生物學和醫學中廣泛應用的方法之一，包括熒光抗體和熒光抗原技術，具有抗原抗體反應的特異性，染色技術的快速性，在細胞或組織上定位的準確性，以及熒光效應的靈敏性等優勢。但是，由于免疫熒光法必須具有熒光顯微鏡，熒光強度隨時間的延長而逐漸消退，結果不易長期保存等缺點，在普及應用上受到一定限制，而逐漸被免疫酶法所取代。

二、IHC/ICC實驗方法

1、儀器設備

（1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫用微波爐；

（2）水浴鍋。

2、試劑

（1）PBS緩沖液（pH7.2~7.4）：NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。

（2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB,pH6.0,1000ml）：檸檬酸三鈉 3g,檸檬酸 0.4g。

（3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O,用10 mmol/L NaOH調至pH8.0,加水至1000ml。

（4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調至pH8.0,加水至1000ml。

（5）酶消化液： a、0.1%*液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配制。 b、0.4%*液：用0.1N的HCl配制。

（6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

（7）封裱劑：

a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0~9.5）等量混合；

b、油和TBS（或PBS）配制。

（8）TBS/PBS pH9.0~9.5,適用于熒光顯微鏡標本；pH7.0~7.4適合于光學顯微鏡標本。

3、操作流程

（1）脫蠟和水化

脫蠟前，應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。

1）組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；

2）無水乙醇中浸泡5分鐘；

3）95%乙醇中浸泡5分鐘；

4）70%乙醇中浸泡5分鐘；

（2）抗原修復

用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。

1）抗原熱修復

在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M*緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。

2）煮沸熱修復

電爐或者水浴鍋加熱0.01M*緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10~15分鐘。

3）微波熱修復

在微波爐里加熱0.01M*緩沖溶液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5~10分鐘，反復1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

4）酶消化方法

常用0.1%*和0.4%*液。*使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間約為5~30分鐘；*消化37℃時間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。

（3）免疫組織化學染色

常見的染色方法有兩種：SP法，SABC法。以下分別列出兩種方法的實驗步驟。

SP法

1）脫蠟、水化；

2） PBS洗2~3次各5分鐘；

3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘

4）PBS洗2~3次各5分鐘；

5）抗原修復；

6）PBS洗2~3次各5分鐘；

7）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。

8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。

9）4℃過夜后需在37℃復溫45分鐘。

10）PBS洗3次各5分鐘；

11）滴加Ⅱ抗40~50μl,室溫靜置，或37℃1小時；

12）抗中可加入0.05%的tween-20.

13）BS洗3次各5分鐘；

14）DAB顯色5~10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；

15）PBS或自來水沖洗10分鐘；

16）蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化；

17）自來水沖洗10~15分鐘；

18）脫水、透明、封片、鏡檢。

SABC法

1）脫蠟、水化。

2）PBS洗兩次各5分鐘。

3）用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5~10分鐘，蒸餾水洗3次。

4） 抗原修復。

5） PBS洗5分鐘。

6） 滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。

7） 滴加Ⅰ抗，室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（4℃過夜后在37℃復溫45分鐘）。

8） PBS洗三次每次2分鐘。

9） 滴加*化二抗，20℃~37℃20分鐘。

10）PBC洗3次每次2分鐘。

11）滴加試劑SABC，20℃~37℃20分鐘。

12）PBS洗4次每次5分鐘。

13）DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。

14）蒸餾水洗。蘇木素復染2分鐘、鹽酸酒精分化。

15）脫水、透明、封片、鏡檢。

原文地址:/biotech/Immunity/2009/k8204950112.html