一、前言
1975年，Kohler和Milstein發現將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交細胞既可產生抗體，又可無限增殖，從而創立了單克隆抗體雜交瘤技術。這一技術上的突破不僅為醫學與生物學基礎研究開創了新紀元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。
制備單克隆抗體包括動物免疫、細胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產，要經過幾個月的一系列實驗步驟。
雖然單抗技術已經非常成熟，但是由于其經濟價值，仍然有很多人在從事這項研究，而且其中也會遇到很多這樣那樣大問題。我本人就是其中一個，由于是*次做單抗，所以過程中遇到了很多困難，終于在前幾天得到了幾株陽性克隆。
鑒于此，我將單克隆抗體制備的整個過程貼出來，同時搜索了園子里面一些戰友的求助帖以及一些經典的應助帖，希望能對將要或是正在從事這項研究的戰友們有些幫助。
二、動物的免疫
選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質量的McAb至關重要。一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應根據抗原的特性不同而定。
1. 顆粒性抗原免疫性較強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細胞性抗原為例的免疫方案:
初次免疫 1×10７／0.5ml ip （腹腔內注射）
↓ 2～3周后
第二次免疫 1×10７／0.5ml ip
↓ 3周后
加強免疫（融合前三天） 1×10７／0.5ml ip或iv（靜脈內注射）
↓
取脾融合
2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏*佐劑，福氏不*佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴散呈小滴狀表明已達到油包水的狀態。商品化福氏*佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏*佐劑皮下多點注射
│ （一般0.8～1ml 0.2ml／點）
↓3周后
第二次免疫 劑量同上，加福氏不*佐劑皮下或ip
│ （ip劑量不宜超過0.5ml）
↓3周后
第三次免疫 劑量同上，不加佐劑，ip
│ （5～7天后采血測其效價，檢測免疫效果）
↓2～3周后
加強免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv
↓3天后
取脾融合
目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆粒化或固相化，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎免疫可直接采用脾內注射。③使用細胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應答水平，促進免疫細胞對抗原反應性
三、骨髓瘤細胞的選取
骨髓瘤細胞能產生并分泌大量的免疫球蛋白，這樣的瘤細胞融合后，可能影響或降低所分泌抗體的滴度，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細胞。
選擇骨髓瘤細胞的條件：①該瘤細胞系的來源應與制備脾細胞小鼠為同一品系，以便兩者的組織相容性抗原一致；②骨髓瘤細胞必須是靜息狀態，不產生γ球蛋白或不分泌到細胞外；③骨髓瘤細胞生長需要一個較高的細胞密度,106個細胞/ml；④生長速度快，繁殖時間短。
目前常用的Balb/c小鼠產生的骨髓瘤細胞株有：①S194/5XXO•BU•1；②SP2／0—Ag14（簡稱SP2，常用）；③P2—X？ ¬—Ag8•6•5•3（簡稱653）；④FO以653zui為常用，它是由礦物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）誘發出來的一種漿細胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并經過培育形成一株8-氮*有抵抗力的亞系。
骨髓瘤細胞一般由有關單位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，試驗時復蘇、增殖、傳代即可。
由于骨髓瘤細胞是半貼壁狀態，很容易脫落，因此不需要*處理。很多書上說為了防止出現返祖現象，在融合前，可將培養基內加入15μg/ml 8－氮*，我個人認為沒有這個必要，因為加入8-AG之后，骨髓瘤細胞一般狀態都不會很好，這樣一來對于融合的影響更大。
四、關于飼養細胞
在體外的細胞培養中，單個的或數量很少的細胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細胞才能使其生長繁殖，加入的細胞稱之為飼養細胞（Feeder cell）。在細胞融合和單克隆的選擇過程中，就是在少量的或單個細胞的基礎上使其生長繁殖成群體，因此在這一過程中必須使用飼養細胞。許多種類的動物細胞都可以做飼養細胞，如正常的脾細胞、胸腺細胞、腹腔滲出細胞等，常選用腹腔滲出細胞，其中主要是巨噬細胞和淋巴細胞。應用腹腔滲出細胞的好處是：一方面做飼養細胞，另一方面巨噬細胞可以吞噬死亡的細胞和細胞碎片，為融合細胞的生長造成良好的環境。腹腔細胞的來源可以是與骨髓瘤細胞同系鼠。也可以是其他種類的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。
1．材料
（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。
（2）11.6％蔗糖溶液（經10磅30min高壓滅菌）。
2．操作方法
（1）拉頸處死小鼠。
（2）70％酒精浸泡消毒10min。
（3）用*將小鼠腹部剪開一小口，剝開皮膚，露出腹腔。
（4）用注射器將4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體，加入離心管。
（5）1 000r／min離心10min。
（6）取上清，以HAT選擇培養液將細胞制成懸液。臺盼藍染色計數活細胞，使每毫升含40萬個活細胞。
（7）以1ml吸管將細胞種入微量培養皿，每孔0.05ml，含2萬個細胞，放入CO2培養箱培養，即可供細胞融合和克隆化之用。如果在融合后發現在培養孔中飼養細胞數量少，則可以在細胞換液時再加入一些。
個人認為取飼養細胞時切忌貪心，別總是想多取一些，因為這樣有可能造成一些不必要的麻煩，我又一次取飼養細胞時就曾經將不知是什么血管刺破，導致所取的飼養細胞里面出現大量的紅細胞。有人說飼養細胞可以不用，我覺得還是用一點比較好，但是一定不要太多，占到30%就足夠了，太多了很影響細胞的觀察，而且會導致骨髓瘤等細胞不能很好的貼壁。
五、取脾臟
融合用的免疫脾細胞指的是處于免疫狀態脾臟中B淋巴母細胞棗漿母細胞。一般取zui后一次加強免疫3天以后的脾臟，制備成細胞懸液，由于此時B淋巴母細胞比例較大，融合的成功率較高。
取脾臟也是一個比較重要的環節，可以說如果出現污染有很大一部分原因是由于融合過程引起的，還有一部分原因就是由于取脾臟這個環節引起的。
取脾臟的要點就是一定要盡量無菌操作，根據實際情況來看，*無菌是不可能的，但是取脾臟的時候一定要盡量減少操作的時間，主要是研磨這一環節。在研磨之前取脾臟之后，首先要將脾臟上面包被的膜剪掉，這樣會節省很多研磨的時間。
脾細胞懸液的制備：在無菌條件下取出脾臟，用不*的培養液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網上，用注射器針芯研磨成細胞懸液后計數。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的２倍，細胞數為２×10８左右。
六、融合與篩選
zui重要的一步是融合，我想這也是單抗制備過程中zui難的一步了。
（一） 細胞融合流程
1 取對數生長的骨髓瘤細胞SP2／0，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不*培養液混懸細胞后計數，取所需的細胞數，用不*培養液洗滌2次。
2 同時制備免疫脾細胞懸液，用不*培養液洗滌2次。
3 將骨髓瘤細胞與脾細胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內用不*培養液洗1次，1200rpm,8分鐘。
4 棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。
5 輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略加松動。
6 在室溫下融合:
①30秒內加入預熱的1ml45％PEG（Merek,分子量4000）含5％DMSO，邊加邊攪拌。
② 作用90秒鐘，若冬天室溫較低時可延長至120秒鐘。
③ 加預熱的不*培養液，終止PEG作用，每隔２分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
7 離心，800rpm，6分鐘。
8 棄上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細胞散開。
9 根據所用96孔培養板的數量，補加*培養液，10ml一塊96孔板。
10 將融合后細胞懸液加入含有飼養細胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培養。
一般一塊96孔板含有1×107脾細胞。
（二） HAT選擇雜交瘤
應用HAT 選擇培養液篩選雜交瘤細胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經提到，這里主要介紹加HAT選擇培養的時間和濃度。
一般在融合24小時后，加HAT選擇培養液。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存，用時1ml加入50ml20％小牛血清*培養液中。
因為在培養板內已加入飼養細胞、融合后的細胞，200μl／孔。所以在加選擇培養液時應加3倍量的HAT。我們認為，融合后zui初補加的量可用全量的2／3進行選擇，可得到滿意的篩選結果。
50×HAT
H: 5×10-3M
A: 2×10-5M
T: 8×10-4M
一般選擇HAT選擇培養液維持培養兩周后，改用HT培養液，再維持培養兩周，改用一般培養液。
融合的關鍵除了無菌操作之外就是動作一定要輕柔，就像制備感受態細胞一樣，而且一定要混勻，不然在鏡下會出現成團的細胞，這是很影響本就不高的融合率的。
七、抗體的鑒定
篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養而獲得雜交細胞系中，僅少數能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細胞布滿孔底1／10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。
檢測抗體的方法應根據抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。
常用的方法有:
1. ELISA用于可溶性抗原（蛋白質）、細胞和病毒等McAb的檢測。
2. RIA用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。
3. FACS（熒光激活細胞分類儀）用于檢查細胞表面抗原的McAb檢測。
4. IFA用于細胞和病毒McAb的檢測。
可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當貽誤整個篩選時機。
八、性質檢測
對制備的McAb進行系統的鑒定是十分必要的。應對其做如下方面的鑒定:
1. 抗體特異性的鑒定：除用免疫原（抗原）進行抗體的檢測外，還應用與其抗原成分相關的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如①制備抗黑色素瘤細胞的McAb，除用黑色素瘤細胞反應外，還應用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關抗原的單克隆抗體。② 制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應，其次是與其它細胞因子間有無交叉。
2. McAb的Ig類與亞類的鑒定：一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選時，已經基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標準抗亞類血清系統作雙擴或夾心ELISA來確定McAb的亞類。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG（3％），將有利于沉淀線的形成。
3. McAb中和活性的鑒定：用動物的或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。
4. McAb識別抗原表位的鑒定：用競爭結合試驗、測相加指數的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。
5. McAb親和力的鑒定：用ELISA或RIA競爭結合試驗來確定McAb與相應抗原結合的親和力。
九、后續工作
克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞；所需要的抗體（特異性抗體）分泌細胞和其它無關抗體分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開，就需要克隆化。克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產生抗體的能力。
（一） 克隆化方案
用克隆化的方法很多，而zui常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。
1. 有限稀釋法的程序
① 制備飼養細胞懸液（同融合前準備）
② 陽性孔細胞的計數，并調細胞數在1～5×10３／ml
③ 取130個細胞放入6.5ml含飼養細胞*培養液，即20個細胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排為每孔2個細胞。余下2.9ml細胞懸液補加2.9ml含飼養細胞的*培養液,細胞數為10個／ml，100μl／孔加D、E、F三排，為每孔1個細胞。余下2.2ml細胞懸液補加2.2ml含飼養細胞的*培養液，細胞數5個／ml，100μl／孔，加G、H兩排，為每孔0.5個細胞。
④ 培養4～5天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆，補加*培養液200μl／孔。
⑤ 第8～9天時，肉眼可見細胞克隆，及時進行抗體檢測。
注:初次克隆化的雜交瘤細胞需要在*培養液中加HT。
2. 軟瓊脂法
① 軟瓊脂的配制
含20％FCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640
1％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預熱。
0.5％瓊脂：由1份1％瓊脂加1份含20％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。
② 用上述0.5％瓊脂液（含有飼養細胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。
③ 按100／ml，500／ml或5000／ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。
④ 1ml 0.5％瓊脂液（42℃預熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。
⑤ 混勻后立即傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。
⑥ 4～5天后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養細胞的24孔板中進行培養。
⑦ 檢測抗體，擴大培養，必要時再克隆化。
（二） 雜交瘤細胞的凍存
及時凍存原始孔的雜交瘤細胞、每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養過程中隨時可能發生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則因為上述的意外而全功盡棄。
雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應在每個凍存管中含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養環境不同而改變，在24孔培養板中培養，當長滿孔底時，一孔就可以凍一管。
細胞凍存液:
50％小牛血清
40％不*培養液
10％ DMSO（二甲亞砜）
凍存液預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到0℃，再降溫時一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或細胞管降至0℃后放-70℃超低溫冰箱，次日轉入液氮中。也可以用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩定性，在液氮中細胞可保存數年或更長時間。
十、tips
由于制備McAb的實驗周期長，環節多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。
其主要失敗原因和影響因素有:
1. 污染：包括細菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中zui辣手的問題。一旦發現有霉菌污染就應及早將污染板棄之，以免污染整個培養環境。支原體的污染主要來源于牛血清，此外，其它添加劑、實驗室工作人員及環境也可能造成支原體污染。在有條件的實驗室，要對每一批小牛血清和長期傳代培養的細胞系進行支原體的檢查，查出污染源應及時采取措施處理。對于污染的雜交瘤細胞可以采取生物學的過濾方法，將污染的雜交瘤細胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待長出腹水或實體瘤時，犖^菌取出分離雜交瘤細胞，一般可除去支原體污染。
2. 融合后雜交瘤不生長：在保證融合技術沒有問題的前提下主要考慮下列因素①PEG有毒性或作用時間過長。②牛血清的質量太差，用前沒有進行嚴格的篩選。③骨髓瘤細胞污染了支原體。④HAT有問題，主要是A含量過高或HT含量不足。
3. 雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體
① 融合后有細胞生長，但無抗體產生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細胞發生突變，變成A抵抗細胞所致。
② 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。
③ 對于原分泌抗體的雜交瘤細胞變為陰性，可能是細胞支原體污染，或非抗體分泌細胞克隆競爭性生長，從而抑制了抗體分泌細胞的生長。也可能發生染色體丟失。Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。
三要:
要大量保持和補充液氮凍存的細胞原管。
要應用倒置顯微鏡經常檢查細胞的生長狀況。
要定期進行再克隆。
三不要:
不要讓細胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細胞將成為優勢，壓倒分泌抗體的雜交瘤細胞。
不要讓培養物不加檢查地任其連續培養幾周或幾個月。
不要不經克隆化而使雜交瘤在機體內以腫瘤生長形式連續傳好幾代。
4. 雜交瘤細胞難以克隆化
可能與小牛血清質量、雜交瘤細胞的活性狀態有關，或由于細胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應在培養液加HT。
