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上海滬宇生物科技有限公司

T淋巴細胞的分離技術

時間:2014-4-28閱讀:311
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(一)原理 
混合單個核細胞懸液在通過尼龍毛柱時,B細胞、漿細胞、單核細胞和一些輔助細胞被選擇性粘附于尼龍毛上,而多數T細胞則通過尼龍毛柱,這是獲得富含T細胞群的有效方法。

(二)材料及試劑

1.尼龍毛(Femwall Laboratories,LP-1 Leukoqak leukocyte Filters)。

2.燒杯、鋁箔、漏斗、一次性手套等。

3.裝填尼龍毛柱,一次性注射器。

4.取自然沉降的上層血漿,過聚蔗糖—*分層液后,獲取的血漿和分層液之間的單個核細胞層。(三)操作方法

1.尼龍毛的清洗與干燥

(1)戴上已經洗去*的一次性手套,將尼龍毛(1包或2包,每包35g)放入燒杯中,加入蒸

水或去離子水,用鋁箔蓋上燒杯并煮沸約10min。

(2)冷卻至常溫,倒入漏斗內,使水滴干。

(3)重復(1)、(2)步驟6次。

(4)將尼龍毛攤在鋪有紗布的方盤內,37℃溫箱干燥2~3天后,貯藏在帶蓋的方盤內。

2.裝尼龍毛柱

(1)取50ml玻璃注射器,拔去注射芯,在注射器頭上套一段帶夾子的膠管。

(2)將尼龍毛梳理,并適當折疊,以適應注射器的直徑,填入注射器內,約20ml的體積。

(3)將填好尼龍毛的注射器連同注射器芯一起包好,高壓滅菌。

3.細胞分離

(1)將注射器固定在支架上,倒入37℃的細胞培養液,關閉閥門一定時間,然后打開閥門,放掉細胞培養液,以清洗幾次尼龍毛,關上閥門。

(2)將要分離的細胞液用預先加溫的培養液稀釋成適當的濃度,約5.00×107個細胞/ml。

(3)將細胞液倒入注射器內,使之沒過尼龍毛柱。蓋上注射器,37℃溫育45min

至1h。

(4)打開下口,緩慢放流(1滴/min),收集于離心管中。

(5)離心,即獲所需的T淋巴細胞。

(6)關閉注射器下口,于注射器內加入0.85%冰冷生理鹽水,振蕩,并套上注射器芯,打開下口,使勁推出注射器內液體,即獲得粘附于尼龍毛上的B淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞等。

(四)注意事項

1.此種分離法,T淋巴細胞也常有一部分被吸附,吸附的多少與尼龍毛的質量有關,與裝柱的松緊也有關系。

2.此法的T淋巴細胞的回收率約20%~30%。

3.用過的尼龍毛可回收,以鹽水洗滌,然后浸入0.1Mol/L的HCl中過夜,然后再同前法清洗。

單核細胞分離技術

(一)鐵粉吸附法

1.材料及試劑

(1)鐵粉或羰基鐵粉(Atomergic chemetals)99%的純度,顆粒小于60µm(Goodfellow Metals)。

(2)強磁鐵(馬蹄形)。

(3)一塊小棒狀磁鐵(約1cm長)。

(4)毛細吸管等。

2.操作方法

(1)稱取一定量的鐵粉,一般為10g,用100ml生理鹽水洗滌4次,去除任何可溶性有毒物質。在倒去鹽水時,用強磁鐵吸住鐵粉。

(2)用50ml生理鹽水混懸鐵粉。搖勻后,分裝于10個瓶中,包扎瓶口,121℃滅菌20min,拿出后立即輕輕搖勻,防止鐵粉結塊,儲藏備用。

(3)臨用前,倒去瓶中的生理鹽水,加入適量的單個核細胞懸液(3ml~5ml,細胞總數為8×107個/瓶)。37℃溫育45min,中間不時晃動,使鐵粉懸浮起來。

(4)加入一塊小磁鐵棒于瓶中,讓其吸住鐵粉以及附著在鐵粉上的細胞。

(5)倒出懸液,此懸液主要是淋巴細胞,離心,收集。

(6)在鐵粉瓶內倒入一定量的Hank’s液,用力振搖后,以強磁鐵吸附,幾分鐘后,倒出液體。

(7)2 000r/min離心液體,管底即為單核細胞。

(二)玻璃板吸附法

將分離的單個核細胞傾于無菌潔凈的玻璃平皿內,置37℃ 30 min~40min,用毛細吸管輕輕吸取懸液,即為淋巴細胞。用適量的Hank’s液沖洗平皿,收獲即為單核細胞懸液。

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