PCR引物設計的原則
引物設計有3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應（即錯配）。
具體實現這3 條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primer length），產物長度（product length），序列Tm 值（melting temperature），引物與模板形成雙鏈的內部穩定性（internal stability, 用?G 值反映），形成引物二聚體（primer dimer）及發夾結構（duplex formation and hairpin）的能值，在錯配位點（false priming site）的引發效率，引物及產物的GC 含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內切酶位點，引進突變等。根據有關參考資料和筆者在實踐中的總結，引物設計應注意如下要點：

1. 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應[2]。
2. 引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現3 個以上的連續堿基，如GGG 或CCC，也會使錯誤引發機率增加[2]。
3. 引物3’端的末位堿基對Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A 的錯配效率明顯高于其他3 個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A[3][4]。另外，引物二聚體或發夾結構也可能導致PCR 反應失敗。5’端序列對PCR 影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物[2]。
4. 引物序列的GC 含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所對應模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使復性條件*。Tm 值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4（G+C）＋2（A+T），在Oligo 軟件中使用的是zui鄰近法（the nearest neighbor method） [6][7]。
6. ?G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性。應當選用3’端?G 值較低（值不超過9），而5’端和中間?G 值相對較高的引物。引物的3’端的?G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA 聚合反應[6]。
7. 引物二聚體及發夾結構的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行[8]。
8. 對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR 產物的載體的相應序列而確定。
值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR 因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。

[2] 擴增較大片段DNA的PCR方法
一般PCR方法在擴增大片段DNA時的局限性：
通常所用的PCR方法都在兩個方面有局限，即目標產物程度和合成片段的大小。Pfu（Pyrococcus furiosus）DNA聚合酶，具有完整的3'外切酶校讀活性（3'-editing-exonuclease），可以將每個循環中堿基的錯配率由10*-4降到10*-3，從而提高PCR產物的準確性。但它在擴增1.5-2.0kb片段時，效率比Klentaq l（Taq DNA聚酶N-末端缺失突變體，類似于E.coli DNA聚合酶I Klenow片段）或AmpliTaq（全長的Taq DNA聚合酶）等聚合酶差；在擴增5.0-7.0kb片段時亦不比各種形式的Taq DNA聚合酶（如Ampli Taq、Klentaq 1、Klentaq 5等N-末端缺失的變異株）有明顯*之處。因而以往的PCR反應產物限制在5.0kb以內。超出這一范圍，PCR擴增反應效率將明顯下降，同時產物會降解。即使將延伸時間定為30分鐘（10倍于通常所需）亦無改進。
利用兩種DNA聚合酶進行較大片段DNA的擴增
美國華盛頓大學醫學院的Barnes WM等對前述問題進行了深入系統的研究，認為：PCR反應效率低zui主要的原因是由于錯配的堿基阻礙了延伸反應的正常進行，Pfu DNA聚合酶雖然可以通過“校讀”功能糾正錯配的堿基，但亦可能降解引物，尤其是在較長反應時間下；酶濃度較高時，反應效果更差。因此必需將Pfu DNA聚合酶的濃度控制在較低狀態，同時配合使用Klentaq l等DNA聚合酶，這樣既可以有效地去除錯配，又可以使Klentaq l等催化的延伸反應順暢進行。實驗證實，按15:1 的比例混合使用Klentaq l和Pfu DNA聚合酶，引物大小為27-33nt,即可使反應有效進行。當然，對于各種不同條件的反應，兩種類型酶的*配比需要具體考慮。
控制脫嘌呤反應增強擴增效率
在PCR反應體系中某些成分耐熱性較差，會影響反應效率。DNA聚合酶的熱穩定性一般都是較好的，可能是模板DNA在溫度較高的環境中某些位點發生脫嘌呤反應從而阻礙反應的順利進行。Lindahl和Nyberg的研究結果顯示：在70℃ pH7.4的條件下， 單鏈DNA脫嘌 呤反應的速度是雙鏈DNA的4倍；100℃ pH7.0時，100kb的堿基中每分鐘將有1個位點脫嘌呤。這一反應與緩沖體系中酸堿度的變化有關。人們注意到：三羥甲基氨基甲烷（Tris）的酸解離常數（pKa）會隨溫度升高而改變，平均每升高1℃，pKa值降低0.03。因而，在25℃時pH8.55的PCR反應體系，到95℃熱變性時，pH值將變為6.45，這就很可能誘導脫嘌呤反應。 為了解決這一問題，可以采取下列措施：
縮短熱變性時間，Barnes等在擴增35kb的大片段時，變性條件為95℃5秒，取得滿意結果；
盡可能使升溫、 降溫過程縮短，可選擇使用導熱性能*的薄壁反應管及較為*的擴增設備；
適當提高反應體系的pH值，反應zui初應控制在pH8.8-9.2范圍；
適當增加延伸時間（可長至20分鐘）。使用這種方法可以擴增zui大為35kb的DNA片段，產物的準確性亦有充分保證，克服了以往基因克隆過程中出現的DNA分子內的堿基重排和可能的毒性危險等問題。

[3] PCR常見問題
PCR產物的電泳檢測時間
一般為48h以內，有些于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。

假陰性，不出現擴增條帶
PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不*。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有 引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條 帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條 亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融 或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出 現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影 響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下 擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

假陽性
出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增 時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽 性。需重新設計引物。
靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交 叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應小心輕柔，防止 將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或 器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。③必要時，在加標本 前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污 染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴 增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現非特異性擴增帶
PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不*互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數 過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶 則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設計引 物。②減低酶量或調換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環次 數。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。

出現片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：①減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃 度。④增加模板量，減少循環次數。

克隆PCR產物
1）克隆PCR產物的*條件是什么？
*插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為*比，摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4oC過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求，為提高連接效率，需4oC過夜。

2）PCR產物是否需要用凝膠純化？
如凝膠分析擴增產物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

3）如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？
A）涂布未轉化的感受態細胞。
如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質粒，或產生氨芐抗型的菌落。
B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。
例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養過夜，產生1000個菌落。轉化率為： 產生菌落的總數/鋪板DNA的總量。
鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為：
1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態細胞
如沒有菌落或少有菌落，感受態細胞的轉化率太低。
C）如用pGEM-T正對照，或PCR產物，產生>20-40藍斑（用步驟10（8次方）cfu/ ug感受態細胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質量標準好無核酸酶污染，不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應為白斑，如產生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。

4）對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？
A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數克隆，為提率，需4oC過夜。
B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數，插入片段需純化，或重新制備。如產生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發生。UV過度照射會產生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。
D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）。
E）高度重復序列可能會不穩定，在擴增中產生缺失和重排，如發現插入片段高頻率地產生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞。

PCR反應體系與反應條件
標準的PCR反應體系：

10×擴增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至 100ul

PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
設計引物應遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的堿基，特別是zui末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以zui低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2。5U（指總反應體積為100ul時），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（ 等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。

模板（靶基因）核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。

PCR反應條件的選擇
PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。

溫度與時間的設置： 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。
①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不*是導致PCR失敗的zui主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物*變性，就會導致PCR失敗。
②退火（復性）溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇zui適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）＋2（A+T）
復性溫度=Tm值-（5～10℃）
在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間*結合。
③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃時， DNA合成幾乎不能進行。
PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。