TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒說明書（通用）
（BIOTIN標記POD法,適用于細胞、組織樣本）
一 TUNEL檢測原理
TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測細胞在凋亡過程中細胞核DNA的斷裂情況，其原理是*（biotin）標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以連接到凋亡細胞中斷裂的DNA的3‘－OH末端，并可與連接了的辣根過氧化酶的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）特異結合，在辣根過氧化酶底物二氨基聯苯胺（DAB）的存在下，產生很強的顏色反應（呈深棕色），特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在普通顯微鏡下即可觀察和計數凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）的凋亡原位檢測。
二 TUNEL試劑盒組分
組 份 20 assays 50 assays 100 assays 儲存條件
Equilibration Buffer 1.0 mL 2.5 mL 5.0 mL -20℃
Biotin-11-dUTP 20μL 50μL 100μL -20℃
TdT Enzyme 80μL 200μL 400μL -20℃
50×Proteinase K 40μL 100μL 200μL -20℃
Streptavidin-HRP 10μL 25μL 50μL 4℃避光
DAB 2mg  5mg  10 mg -20℃
TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒說明書注意事項
1 使用前請認真閱讀本說明書，提前準備好相關試劑。
2 因本試劑盒中組分均為微量，使用前請離心集液。
3 為避免試驗誤差、降低試劑的損耗，建議使用精密度高的進口微量移液槍及槍頭。
4 TdT 酶反應液在使用前根椐樣本數量集中配制，再分別滴加于各樣本片上，避免每個樣本單獨配制而產生的試劑損耗。
5 另因DAB為固體粉末，使用前加入適量PBS溶解，配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按下述方法顯色使用。
6 用戶自備：二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2 、TritonX-100、檸檬酸鈉、復染染液：蘇木素或甲基綠等、蓋玻片、載玻片、染色缸。
三 操作流程概覽
 
本試劑盒特點● 操作簡便：使用Ready-to-Use型試劑，并配有Proteinase K 和DAB。
● 高靈敏度：可以單一檢出初期的凋亡細胞。
● 高特異性：能特異性染色凋亡細胞。
● 快速操作：整體操作約需3小時。
● 用途廣泛：可應用于組織切片、細胞樣本等。
● 方便觀察：使用光學顯微鏡觀察實驗結果。
● 高正確性：有陽性對照片的制備方法，可以確認試劑盒的有效性
四 檢測樣本的預處理
TUNEL檢測時樣本的預處理是試驗的關鍵所在，本說明書推薦的條件僅為普遍情況，用戶需根椐自已的樣本材料及試驗結果來調整各個條件（參照Page 9），如處理時間、處理濃度等，來優化出適合自身樣本的試驗條件，從而做出客觀的試驗結果。
1 細胞樣本的準備.
 

TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒說明書操作注意事項：
1. 為防止樣本脫落，請使用硅烷（Silane）處理的載玻片或采用多聚賴氨酸鋪片。
2. 固定好的樣本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分鐘～一晚，以改善細胞的滲透性。
3. 使用PBS清洗細胞樣本時，不要直接加在細胞樣本上，以防止細胞樣本的脫落。
4. 進行PBS清洗時，以5分鐘清洗3次為標準。
5. 固定液、PBS、封閉液、通透液、染色缸需用戶自備，請按上述方法配制。
2 石蠟組織切片的預處理
 

* 注意事項：蛋白酶K處理的使用濃度、處理時間及溫度，都因組織的類型不同而有所不同，需要自已摸索優化上述條件，如有問題，請根椐本說明書Page 9的《常見問題的原因及推薦解決方案》來調整條件。例如：如果凋亡細胞染色較弱時，可用高濃度的Proteinase K（400μg/ml）處理5分鐘。（本試劑盒的50×Proteinase K濃度為1mg/ml）。
其它替代方法： 石蠟切片的預處理也可根椐實際情況可采用下述三種替代方法之一，即蛋白酶K處理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：
替代方法1: 將脫蠟及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液：0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉，需新鮮配制）
替代方法2： 將脫蠟及水合好的切片浸入*或*中8-10 min（*：0.25%-0.5%溶于HCl PH2，*0.25%-0.5%溶于0.01N HCl ）
替代方法3: 將脫蠟及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的檸檬酸緩沖液PH 6 的塑料盒中，置于微波爐中350W（低檔）處理5 min。
3 冰凍切片的預處理
 
4 其它難于處理的組織切片的預處理
 
5 陽性對照及陰性對照的準備
TUNEL檢測同時需要設陽性和陰性對照，以顯示試驗的客觀性及準確性。因此需要按下述方法準備兩個樣本來制備陽性及陰性片，其后續步聚與待測樣本同樣進行。
A：陽性對照樣本的準備
組織樣本在蛋白酶K處理、PBS浸洗后，細胞樣本在Triton X-100通透液處理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反應液（10U-3000U DNase I，40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2）（用戶自備）室溫—37℃處理10 —30 min，其余步驟均相同。如有問題詳見Page 9.
B：陰性對照樣本的準備
在Page 8標記反應制備TdT酶反應液時，不添加TdT酶，其余步驟均相同。
五 標記和顯色反應：
 
操作注意事項：
1. 進行PBS清洗時，以5分鐘清洗3次為標準。
2. PBS清洗后，為了各種反應的有效進行，請盡量除去PBS溶液后再進行下一步反應
3. 在載玻片上的樣本上加上實驗用反應液后，請蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進行，這樣可以使反應液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應液干燥造成實驗失敗。
4. TdT酶反應液即用即配，短暫于冰上保存。不宜長期保存，長期保存會導酶活性的失活。
5. 如果20×DAB溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。
6. 用甲基綠（Methyl Green）染液（3-5%甲基綠溶于0.1M醋酸* PH4.0）染色后，請用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進行洗凈（100%乙醇）、脫水（二甲苯）透明、封片后通過光學顯微鏡觀察操作。如果此時使用80～90%的乙醇洗凈時，甲基綠比較容易脫色，注意快速進行脫水操作。