因?yàn)?strong>ELISA試劑盒測(cè)定中單個(gè)空缺孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測(cè)定或同次測(cè)定空缺孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值，所以在ELISA測(cè)定比色時(shí)，是使用雙波長(zhǎng)比色。ELISA試劑盒因此，雙波長(zhǎng)比色測(cè)定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度的影響的長(zhǎng)處。ELISA試劑盒比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按劃定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。
    zui后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長(zhǎng)下的吸光度值與非常感波長(zhǎng)下的吸光度值的差。以軟板為載體的試驗(yàn)，需先將板置于尺度96孔的座架中，才可進(jìn)行比色。ELISA試劑盒比色時(shí)應(yīng)先以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔。
   所謂的單波長(zhǎng)比色等于通常的以對(duì)顯色具有zui大吸收的波長(zhǎng)如450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定；而雙波長(zhǎng)雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長(zhǎng)如450nm和非敏感波長(zhǎng)630nm下各測(cè)定一次，敏感波上下的吸光度測(cè)定值為樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長(zhǎng)下測(cè)定即改變波長(zhǎng)至一定值，ELISA試劑盒使得樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時(shí)測(cè)得的吸光度即為臟物的吸光度值。

    以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，ELISA試劑盒而前者比色波長(zhǎng)為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換。