ELISA試劑盒雙抗夾心法試劑盒測抗原的注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作ELISA雙抗夾心法試劑盒檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。采用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由于去除了Fc段，從而可消除RF的干擾。ELISA雙抗夾心法試劑盒ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標。
ELISA試劑盒抗原zui常用的方法，操作步驟如下：
1、將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。
2、加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。
3、洗滌除去其他未結合的物質。
4、加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。*洗滌未結合的酶標抗體。
5、此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
6、加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。
7、根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
ELISA試劑盒雙抗夾心法試劑盒一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步法檢測。如按常法測讀，所得結果將低于實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應，因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質時，應注意可測范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
ELISA試劑盒在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"夾心復合物"。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現象，此時反應后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標準曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同。