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（sTRAIL）人可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（sTRAIL）Elisa試劑盒說明書

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 Human Soluble Tumor necrosis

         Factor-related Apoptosis

      Inducing Ligand  （（sTRAIL））

                                               （（                   ））

                           ELISA KIT

                      Catalog No. CSB-E04750h

                                    （96T）

    This immunoassay kit allows for the in vitro quantitative determination of human

    sTRAIL  concentrations   in  cell   culture   supernates,   serum,   plasma  and   other

    biological fluids.

    Expiration date   six months from the date of manufacture

    FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.

                       CUSABIO BIOTECH CO., Ltd.

              /    /

           : cusabio@       cusabio@

                                       1

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INTRODUCTION

TRAIL      （tumor    necrosis    factor-related    apoptosis-inducing      ligand）   is  a

recently   identified   member   of    the   TNF   gene   superfamily.   Five    different

receptors have been identified for TRAIL. Two receptors, DR4 and DR5, are

transmembrane proteins containing death domain similar to FAS and other

TNF family receptors. Two other receptors, DcR1 and DcR2, act like decoy

proteins for TRAIL binding because they lack the death domain. TRAIL can

also   bind,   though   weakly,    to   osteoprotegrin   （OPG）,  a   soluble   receptor,

which    plays   a  role   in  osteoclastogenesis.      TRAIL   induces     apoptosis    in

various tumor cell lines, whereas most primary cells seem to be resistant.

TRAIL-mediated   apoptosis         occurs   following    its   binding   to  DR4   or   DR5

receptors.   The   mechanism   of   apoptosis   involves   activation   of   caspase-8

and   subsequent   activation   of   effector   caspases.   Also,   NF- κB   and   JNK

activation play a role in the TRAIL signaling pathway.TRAIL expression is

detectable in many normal organs and tissues. Several studies suggest that

TRAIL may  play  a   physiological   role   by  contributing  to   immune   privilege,

normal cellular development, and inhibition of autoimmune responses. The

expression of TRAIL is upregulated in activated T cells, B cells, NK cells,

monocytes   and   macrophages.   LPS   activation   stimulates   the   release   of

soluble   TRAIL   from   monocytes   and   macrophages,   suggesting   a   role   of

TRAIL   in   their  cytotoxic/phagocytic      function.   Also,   TRAIL   expression     is

increased in transformed cell lines and various diseases including cancer

and autoimmune disorders. TRAIL may also be involved in

activation-induced   T   cell   death   during   HIV   infection.   Certain   anti-cancer

agents   also   upregulate   TRAIL   and   TRAIL   receptor   expression   on   tumor

cells, thus sensitizing cells to apoptosis.

                                            2

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PRINCIPLE OF THE ASSAY

The    microtiter   plate  provided    in  this  kit  has  been  pre-coated     with  an

antibody specific to sTRAIL. Standards or samples are then added to the

appropriate     microtiter   plate   wells   with   a  biotin-conjugated     polyclonal

antibody     preparation    specific   for  sTRAIL.     and   Avidin    conjugated     to

Horseradish      Peroxidase     （HRP）    is  added   to  each    microplate   well   and

incubated. Then a TMB （3,3'5, 5' tetramethyl-benzidine） substrate solution

is    added    to   each    well.   Only    those    wells   that   contain    sTRAIL,

biotin-conjugated      antibody   and   enzyme-conjugated        Avidin  will  exhibit  a

change     in  color.  The   enzyme-substrate       reaction   is  terminated    by  the

addition   of   a   sulphuric   acid   solution   and   the   color   change   is   measured

spectrophotometrically        at  a   wavelength     of   450   nm    ±  2    nm.   The

concentration of sTRAIL. in the samples is then determined by comparing

the O.D. of the samples to the standard curve.

DETECTION RANGE

15.6   pg/ml-1000   pg/ml.   The   standard   curve   concentrations   used   for   the

ELISA’s were 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml,125 pg/ml, 62.5 pg/ml, 31.2

pg/ml, 15.6 pg/ml.

SPECIFICITY

This    assay    recognizes     recombinant     and    natural   human     sTRAIL    No

significant cross-reactivity or interference was observed.

                                           3

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SENSITIVITY

The minimum detectable dose of human sTRAIL is typically less than 3.9

pg/ml.

The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection （LLD） was defined

as the lowest protein concentration that could be differentiated from zero.

MATERIALS PROVIDED

              Reagent                                    Quantity

              Assay plate                                     1

              Standard                                        2

              Sample Diluent                             1 x 20 ml

              Biotin-antibody Diluent                    1 x 10 ml

              HRP-avidin Diluent                         1 x 10 ml

              Biotin-antibody                            1 x 120μl

              HRP-avidin                                 1 x 120μl

                                                         1 x 20 ml

              Wash Buffer

                                                      （25×concentrate）

              TMB Substrate                              1 x 10 ml

              Stop Solution                              1 x 10 ml

STORAGE

1.   Unopened   test   kits   should   be   stored   at   2-8°C   upon   receipt   and   the

    microtiter plate should be kept in a sealed bag. The test kit may be used

    throughout the expiration date of the kit. Refer to the package label for

    the expiration date.

                                        4

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2.   Opened      test  kits  will  remain   stable   until  the   expiring   date   shown,

    provided it is stored as prescribed above.

3.   A   microtiter   plate   reader   with   a   bandwidth   of   10   nm   or   less   and   an

    optical   density   range   of   0-3   OD   or   greater   at   450nm   wavelength   is

    acceptable for use in absorbance measurement.

REAGENT PREPARATION

Bring all reagents to room temperature before use.

1.   Wash Buffer         If crystals have formed in the concentrate, warm up to

     room   temperature   and   mix   gently   until   the   crystals  have   compley

     dissolved. Dilute 20 ml of Wash Buffer Concentrate  into deionized or

     distilled water to prepare 500 ml of Wash Buffer.

2.   Standard        Reconstitute the Standard with 1.0 ml of Sample Diluent.

     This reconstitution produces a stock solution of 1000 pg/ml. Allow the

     standard to sit for a minimum of 15 minutes with gentle agitation prior to

     making   serial     dilutions.  The   undiluted    standard    serves    as  the   high

     standard     （1000    pg/ml）.    The  Sample       Diluent    serves    as   the  zero

     standard （0 pg/ml）.

3.   Biotin-antibody            Dilute    to   the    working      concentration      using

     Biotin-antibody Diluent（1:100）, respectively.

4.   HRP-avidin        Dilute   to   the   working   concentration   using   HRP-avidin

     Diluent（1:100）, respectively.

Precaution: The Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear

             eye, hand, face, and clothing protection when using this material.

                                             5

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OTHER SUPPLIES REQUIRED

     Microplate   reader   capable   of   measuring   absorbance  at   450   nm,   with

    the correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.

     Pipettes and pipette tips.

     Deionized or distilled water.

     Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer.

SAMPLE COLLECTION AND STORAGE

     Cell Culture Supernates        Remove particulates by centrifugation and

    assay immediay or aliquot and store samples at -20° C. Avoid

     repeated freeze-thaw cycles.

    Serum      Use a serum separator tube （SST） and allow samples to clot

    for 30 minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 g. Remove

    serum and assay immediay or aliquot and store samples at -20° C.

    Avoid repeated freeze-thaw cycles.

     Plasma     Collect plasma using citrate, EDTA, or heparin as an

    anticoagulant. Centrifuge for 15 minutes at 1000 x g within 30 minutes

    of collection. Assay immediay or aliquot and store samples at -20° C.

    Avoid repeated freeze-thaw cycles.

Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.

ASSAY PROCEDURE

Bring all reagents and samples to room temperature before use. It is

recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.

                                         6

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 1.   Add   100μl   of   Standard,   Blank,   or   Sample   per   well.   Cover   with   the

     adhesive strip. Incubate for 2 hours at 37° C.

 2.   Remove the liquid of each well, don’t wash.

 3.   Add 100μl of Biotin-antibody working solution to each well. Incubate

     for   1  hour    at  37°C.   Biotin-antibody   working          solution    may    appear

     cloudy.   Warm   up   to   room   temperature   and   mix   gently  until   solution

     appears uniform.

 4.   Aspirate each well and wash, repeating the process three times for a

     total of three washes. Wash by filling each well with Wash Buffer （200μl）

     using     a  squirt   bottle,   multi-channel      pipette,   manifold     dispenser     or

     autowasher.   Complete   removal   of   liquid   at   each   step   is   essential   to

     good   performance.   After   the   last   wash,   remove   any   remaining Wash

     Buffer   by   aspirating   or   decanting.   Invert   the   plate  and   blot   it   against

     clean paper towels.

 5.   Add   100μl   of  HRP-avidin   working   solution   to   each   well.   Cover   the

     microtiter plate with a new adhesive strip. Incubate for 1 hour at 37° C.

 6.   Repeat the aspiration and wash three times as step 4.

 7.   Add 90μl of TMB Substrate to each well. Incubate for 30 minutes at

     37°C.     Keeping     the   plate   away    from    drafts   and    other  temperature

     fluctuations in the dark.

 8.   Add   50μl   of  Stop   Solution   to   each   well.   If   color   change   does   not

     appear uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.

 9.   Determine the optical density of each well within 30 minutes, using a

     microplate reader set to 450 nm.

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CALCULATION OF RESULTS

Average the duplicate readings for each standard, control, and sample and

subtract the average zero standard optical density. Create a standard curve

by reducing the data using computer software capable of generating a four

parameter   logistic   （4-PL）curve-fit.   As   an   alternative,   construct   a   standard

curve   by   plotting   the   mean   absorbance   for   each   standard   on   the   y-axis

against the concentration on the x-axis and draw a best fit curve through the

points on the graph. The data may be linearized by plotting the log of the

sTRAIL. concentrations versus the log of the O.D. and the best fit line can

be    determined     by  regression     analysis.   This  procedure     will  produce    an

adequate but less precise fit of the data. If samples have been diluted, the

concentration      read   from   the  standard    curve    must   be  multiplied    by  the

dilution factor.

LIMITATIONS OF THE PROCEDURE

      The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.

      Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.

      It is important that the Calibrator Diluent selected for the standard curve

     be consistent with the samples being assayed.

      If samples generate values higher than the highest standard, dilute the

     samples with the appropriate Calibrator Diluent and repeat the assay.

      Any    variation   in  Standard     Diluent,    operator,    pipetting   technique,

     washing   technique,   incubation   time   or   temperature,  and   kit   age   can

     cause variation in binding.

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      This assay is designed to eliminate interference by soluble receptors,

     binding proteins, and other factors present in biological samples. Until

     all  factors   have    been    tested   in  the   Quantikine    Immunoassay,        the

     possibility of interference cannot be excluded.

TECHNICAL HINTS

      When mixing or reconstituting protein solutions, always avoid foaming.

      To avoid cross-contamination, change pipette tips between additions of

     each standard level, between sample additions, and between reagent

     additions. Also, use separate reservoirs for each reagent.

      When   using   an   automated   plate   washer,   adding   a   30  second   soak

     period   following   the   addition   of   wash   buffer,   and/or   rotating   the   plate

     180 degrees between wash steps may improve assay precision.

      To   ensure   accurate   results,   proper   adhesion   of   plate   sealers   during

     incubation steps is necessary.

      Substrate   Solution   should   remain   colorless   until   added   to   the   plate.

     Keep Substrate Solution protected from light. Substrate Solution should

     change from colorless to gradations of blue.

      Stop Solution should be added to the plate in the  same order as the

     Substrate Solution. The color developed in the wells will turn from blue

     to   yellow   upon   addition   of   the   Stop   Solution. Wells  that   are   green   in

     color indicate that the Stop Solution has not mixed thoroughly with the

     Substrate Solution.

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   人可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體人可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（sTRAIL）

   人可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體人可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體

               酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書試劑盒使用說明書

               酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

產品編號產品編號：：CSB-E04750h

產品編號產品編號：：

檢測范圍檢測范圍：：15.6 pg/ml - 1000 pg/ml

檢測范圍檢測范圍：：

zui低檢測限zui低檢測限：：3.9 pg/ml

zui低檢測限zui低檢測限：：

特異性特異性：：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人sTRAIL，且與其他相關蛋

特異性特異性：：

白無交叉反應。

有效期有效期：：6 個月

有效期有效期：：

預期應用預期應用：：ELISA 法定量測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關生

預期應用預期應用：：

物液體中sTRAIL 含量。

說明說明

說明說明

1.  試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。

2.  濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

3.  中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。

4.  剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現(xiàn)象，不會對實

    驗結果造成任何影響。

實驗原理實驗原理

實驗原理實驗原理

     用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗sTRAIL 抗體的微

孔中依次加入標本或標準品、*化的抗sTRAIL 抗體、HRP 標記的親和

素，經過*洗滌后用底物TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成

藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的sTRAIL.

呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度 （OD 值），計算樣品濃度。

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試劑盒組成及試劑配制試劑盒組成及試劑配制

試劑盒組成及試劑配制試劑盒組成及試劑配制

1.  酶聯(lián)板酶聯(lián)板（Assay plate ）：                                      一塊（96 孔）。

    酶聯(lián)板酶聯(lián)板

2.  標準品標準品（Standard）：                                          2 瓶（凍干品）。

    標準品標準品

3.  樣品稀釋液樣品稀釋液（Sample Diluent）：                                  1×20ml/瓶。

    樣品稀釋液樣品稀釋液

4.  *標記抗體稀釋液*標記抗體稀釋液（（Biotin-antibody Diluent）：）             1×10ml/瓶。

    *標記抗體稀釋液*標記抗體稀釋液（（                            ））

5.  辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液（（HRP-avidin Diluent）：）  1×10ml/瓶。

    辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液（（                         ））

6.  *標記抗體*標記抗體（（Biotin-antibody）：）                 1×120μl/瓶（1：100）。

    *標記抗體*標記抗體（（                   ））

7.  辣根過氧化物酶標記親和素辣根過氧化物酶標記親和素（（HRP-avidin）：）           1×120μl/瓶（1：100）。

    辣根過氧化物酶標記親和素辣根過氧化物酶標記親和素（（                ））

8.  底物溶液底物溶液（（TMB Substrate）：）                                   1×10ml/瓶。

    底物溶液底物溶液（（                  ））

9.  濃洗滌液濃洗滌液（（Wash Buffer ）：）1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。

    濃洗滌液濃洗滌液（（               ））

10. 終止液終止液（（Stop Solution）：）                       1×10ml/瓶（2N H SO4）。

    終止液終止液（（                ））                                       2

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材

1.  標準規(guī)格酶標儀

2.  高速離心機

3.  電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.  干凈的試管和Eppendof 管

5.  系列可調節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器

6.  蒸餾水，容量瓶等

標本的采集及保存標本的采集及保存

標本的采集及保存標本的采集及保存

1.  血清：全血標本請于室溫放置2 小時或4℃過夜后于1000 x g 離心20 分

    鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍

    融。

2.  血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后30 分鐘內于2 - 8° C

    1000 x g 離心15 分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復

    凍融。

3.  細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000 x g 離心20 分鐘，取上清即可檢

    測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

注：注：標本溶血會影響zui后檢測結果標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測，因此溶血標本不宜進行此項檢測。。

注注：：標本溶血會影響zui后檢測結果標本溶血會影響zui后檢測結果，，因此溶血標本不宜進行此項檢測因此溶血標本不宜進行此項檢測。。

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標本的稀釋原則標本的稀釋原則：：

標本的稀釋原則標本的稀釋原則：：

首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。

只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應

做好詳細的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。

標準品的稀釋原則標準品的稀釋原則：：2 瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好

標準品的稀釋原則標準品的稀釋原則：：

后靜置10 分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為1000   pg/ml，

做系列倍比稀釋后，分別稀釋1000 pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml,125 pg/ml,

62.5 pg/ml, 31.2 pg/ml, 15.6 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml，

臨用前15 分鐘內配制。

如配制500pg/ml 標準品：取0.5ml  （不要少于0.5ml）1000 pg/ml 的上述標

準品加入含0.5ml 樣品稀釋液的Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此

類推。

*標記抗體的稀釋原則*標記抗體的稀釋原則：：

*標記抗體的稀釋原則*標記抗體的稀釋原則：：

臨用前以*標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所

需的總量配制 （每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl 生物

素標記抗體加990μl *標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用

前一小時內配制。

辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：：

辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：：

臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的

每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如

10μl 辣根過氧化物酶標記親和素加990μl 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液

的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。

操作步驟操作步驟

操作步驟操作步驟

實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻

時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品

稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

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1.  加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，

    余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于

    酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，

    37℃反應120 分鐘。

    為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.  棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加*標記抗體工作液 100μl （取1μl

    *標記抗體加99μl *標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，

    在使用前一小時內配制），37℃,60 分鐘。

3.  溫育60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分鐘，

    200μl/每孔，甩干。

4.  每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液 （同*標記抗體工作液）

    100μl，37℃，60 分鐘。

5.  溫育60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分鐘，

    200μl/每孔，甩干。

6.  依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色 （（30 分鐘內，此時肉眼可見標

                                               （（

    準品的前3-4 孔有明顯的梯度藍色，后3-4 孔梯度不明顯，即可終止）。

7.  依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加

    入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底

    物反應時間到后應盡快加入終止液。

8.  用酶聯(lián)儀在450nm 波長依序測量各孔的光密度 （OD 值）。 在加終止液

    后15 分鐘以內進行檢測。

實驗備注實驗備注

實驗備注實驗備注

1.  用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到

    管底。

2.  每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶

    液及2N H SO4。測量時先用此孔調OD 值至零。

              2

3.  為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上

    蓋或覆膜。

4.  未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、*標記抗體

    工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據所需的量配置使用。請

    勿重復使用已稀釋過的標準品、*標記抗體工作液、或辣根過氧化物

    酶標記親和素工作液。

5.  建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。

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洗板方洗板方法法

洗板方洗板方法法

手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上

鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml

注入孔內，浸泡1-2 分鐘。根據需要，重復此過程數次。

 自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

計算計算

計算計算

以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD 值為縱坐標（普通坐標），在半對

數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；

再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方

程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即

為樣品的實際濃度。

注意事項注意事項

注意事項注意事項

1.  底物請避光保存。

2.  當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。

3.  請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。

4.  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

5.  不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

6.  一次加樣時間控制在5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

7.  在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

8.  如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋

    倍數。

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