国产精自产拍久久久久久蜜,亚洲视频在线观看,亚洲小说图片,国产伦精品一区二区三区免.费

（LEP）人瘦素（LEP）ELISA試劑盒

----------------------- Page 1-----------------------

                Human Leptin （LEP）

                             ELISA Kit

                       Catalog No. CSB-E04649h

                                   （96 tests）

    This immunoassay kit allows for the in vitro quantitative determination of human

    LEP   concentrations  in cell  culture  supernates,  serum,  plasma  and  other

    biological fluids.

    Expiration date    six months from the date of manufacture

    FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.

                          CUSABIO BIOTECH CO., Ltd.

                  /  /

               : cusabio@     cusabio@

                                         1

----------------------- Page 2-----------------------

INTRODUCTION

Leptin   is   a   16   kDa   protein   hormone   that   plays   a   key   role   in   regulating

energy intake and energy expenditure, including appetite and metabolism.

Leptin is one of the most important adipose derived hormones. The Ob（Lep）

gene （Ob for obese, Lep for leptin） is located on chromosome 7 in humans.

Leptin interacts with six types of receptors （Ob-Ra–Ob-Rf, or LepRa-LepRf）

which   in   turn   are   encoded   by   a   single   gene,   LEPR.   Ob-Rb   is   the   only

receptor isoform that can signal intracellularly via the Jak-Stat and MAPK

signal transduction pathways, and is present in hypothalamic nuclei.

In addition to being a biomarker for body fat, serum leptin levels also reflect

individual    energy     balance.    Several    studies   have    shown    that   fasting   or

following a very low calorie diet （VLCD） lowers leptin levels. It might be that

on short term leptin is an indicator of energy balance. This system is more

sensitive   to   starvation   than   to   overfeeding,   i.e.   leptin   levels   do   not   rise

extensively after overfeeding. It might be that the dynamics of leptin due to

an acute change in energy balance are related to appetite and eventually to

food intake. Although this is a new hypothesis, there are already some data

that support it.

Leptin binds to the ventromedial nucleus of the hypothalamus, known as

the   "appetite   center."   Leptin   signals   to   the   brain  that   the   body   has   had

enough      to   eat,  or   satiety.   A   very   small   group     of  humans      possess

homozygous （same on both of the pair） mutations for the leptin gene which

leads     to  a  constant    desire   for  food,   resulting    in  severe   obesity.    This

condition can be treated successfully by the administration of recombinant

human leptin. Thus, circulating leptin levels give the brain input regarding

energy storage so it can regulate appetite and metabolism. Leptin works by

inhibiting   the   activity   of   neurons   that   contain   neuropeptide   Y   （NPY）   and

                                              2

----------------------- Page 3-----------------------

agouti-related   peptide   （AgRP）,   and   by   increasing   the   activity   of   neurons

expressing      α-melanocyte-stimulating          hormone      （α-MSH）.      Leptin    is  also

strongly   linked   with   angiogenesis,   increasing  Vascular   endothelial  growth

factor （VEGF） levels.

Although   leptin   is   a   circulating   signal   that   reduces   appetite,   in   general,

obese   people   have   an   unusually   high   circulating   concentration   of   leptin.

These people are said to be resistant to the effects of leptin, in much the

same way that people with type 2 diabetes are resistant to the effects of

insulin.    The   high   sustained     concentrations      of  leptin   from   the   enlarged

adipose stores result in leptin desensitization. The pathway of leptin control

in   obese     people    might   be   flawed    at  some     point   so  the   body    doesn't

adequay receive the satiety feeling subsequently to eating.

PRINCIPLE OF THE ASSAY

The     microtiter   plate   provided     in  this  kit  has   been   pre-coated      with   an

antibody   specific   to   LEP.   Standards   or   samples   are  then   added   to   the

appropriate       microtiter    plate   wells   with    a  biotin-conjugated       polyclonal

antibody preparation specific for LEP and Avidin conjugated to Horseradish

Peroxidase （HRP） is added to each microplate well and incubated. Then a

TMB   （3,3'5,  5'  tetramethyl-benzidine）   substrate   solution   is added to   each

well.   Only   those   wells   that   contain   LEP,   biotin-conjugated   antibody   and

enzyme-conjugated            Avidin     will   exhibit    a    change       in   color.    The

enzyme-substrate reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid

solution   and   the   color   change   is   measured   spectrophotometrically   at   a

wavelength of 450 nm ± 2 nm. The concentration of LEP in the samples is

then   determined   by   comparing   the   O.D.   of   the   samples   to   the   standard

curve.

                                               3

----------------------- Page 4-----------------------

DETECTION RANGE

0.32   ng/ml-20   ng/ml.  The   standard   curve  concentrations    used  for  the

ELISA’s were 20 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml,2.5 ng/ml, 1.25 ng/ml, 0.62 ng/ml,

0.32 ng/ml.

SPECIFICITY

This assay recognizes recombinant and natural human LEP. No significant

cross-reactivity or interference was observed.

SENSITIVITY

The   minimum   detectable   dose   of   human   LEP   is   typically   less   than   0.08

ng/ml.

The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection （LLD） was defined

as the lowest protein concentration that could be differentiated from zero.

MATERIALS PROVIDED

              Reagent                                    Quantity

              Assay plate                                    1

              Standard                                       2

              Sample Diluent                             1 x 20 ml

              Biotin-antibody Diluent                    1 x 10 ml

              HRP-avidin Diluent                         1 x 10 ml

              Biotin-antibody                            1 x 120l

              HRP-avidin                                 1 x 120l

                                                         1 x 20 ml

              Wash Buffer

                                                      （25×concentrate）

              TMB Substrate                              1 x 10 ml

              Stop Solution                              1 x 10 ml

                                        4

----------------------- Page 5-----------------------

STORAGE

1.   Unopened   test   kits   should   be   stored   at   2-8°C   upon   receipt   and   the

    microtiter    plate   should   be   kept   in  a  sealed   bag    with  desiccants     to

    minimize exposure to damp air. The test kit may be used throughout the

    expiration date of the kit. Refer to the package label for the expiration

    date.

2.   Opened      test  kits  will  remain   stable   until  the   expiring   date   shown,

    provided it is stored as prescribed above.

3.   A   microtiter   plate   reader   with   a   bandwidth   of   10   nm   or   less   and   an

    optical   density   range   of   0-3   OD   or   greater   at   450nm   wavelength   is

    acceptable for use in absorbance measurement.

REAGENT PREPARATION

Bring all reagents to room temperature before use.

1.   Wash   Buffer        If   crystals   have   formed   in   the   concentrate,   warm   to

     room   temperature   and   mix   gently   until   the   crystals  have   compley

     dissolved. Dilute 20 ml of Wash Buffer Concentrate  into deionized or

     distilled water to prepare 500 ml of Wash Buffer.

2.   Standard       Reconstitute the Standard with 1.0 ml of Sample Diluent.

     This   reconstitution   produces   a   stock   solution   of   20   ng/ml.   Allow   the

     standard to sit for a minimum of 15 minutes with gentle agitation prior to

     making   serial     dilutions.  The   undiluted    standard    serves    as  the   high

     standard （20 ng/ml）. The Sample Diluent serves as the zero standard

     （0 ng/ml）.

3.   Biotin-antibody            Dilute    to   the    working      concentration      using

     Biotin-antibody Diluent（1:100）, respectively.

                                             5

----------------------- Page 6-----------------------

4.   HRP-avidin       Dilute   to   the   working   concentration   using HRP-avidin

     Diluent（1:100）, respectively.

Precaution: The Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear

            eye, hand, face, and clothing protection when using this material.

OTHER SUPPLIES REQUIRED

     Microplate   reader   capable   of   measuring   absorbance  at   450   nm,   with

     the correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.

     Pipettes and pipette tips.

     Deionized or distilled water.

     Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer.

SAMPLE COLLECTION AND STORAGE

     Cell Culture Supernates         Remove particulates by centrifugation and

     assay immediay or aliquot and store samples at -20° C. Avoid

     repeated freeze-thaw cycles.

     Serum     Use a serum separator tube （SST） and allow samples to clot

    for 30 minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 x g. Remove

     serum and assay immediay or aliquot and store samples at -20° C.

    Avoid repeated freeze-thaw cycles.

     Plasma     Collect plasma using citrate, EDTA, or heparin as an

     anticoagulant. Centrifuge for 15 minutes at 1000 x g within 30 minutes

     of collection. Assay immediay or aliquot and store samples at -20° C.

    Avoid repeated freeze-thaw cycles.

Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.

                                          6

----------------------- Page 7-----------------------

ASSAY PROCEDURE

Bring all reagents and samples to room temperature before use. It is

recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.

1.    Add   100l   of   Standard,   Blank,   or   Sample   per   well.   Cover   with   the

     adhesive strip. Incubate for 2 hours at 37° C.

2.    Remove the liquid of each well, don’t wash.

3.    Add 100l of Biotin-antibody working solution to each well. Incubate

     for   1  hour   at  37°C.   Biotin-antibody   working        solution   may    appear

     cloudy.    Warm      to  room    temperature      and   mix   gently    until  solution

     appears uniform.

4.    Aspirate each well and wash, repeating the process three times for a

     total of three washes. Wash by filling each well with Wash Buffer （200l）

     using    a   squirt  bottle,   multi-channel     pipette,   manifold    dispenser     or

     autowasher.   Complete   removal   of   liquid   at   each   step   is   essential   to

     good   performance.   After   the   last   wash,   remove   any   remaining Wash

     Buffer   by   aspirating   or   decanting.   Invert   the   plate  and   blot   it   against

     clean paper towels.

5.    Add   100l   of  HRP-avidin   working   solution   to   each   well.   Cover   the

     microtiter plate with a new adhesive strip. Incubate for 1 hour at 37° C.

6.    Repeat the aspiration and wash three times as step 4.

7.    Add 90l of TMB Substrate to each well. Incubate for 10-30 minutes at

     37°C.    Keeping     the  plate   away    from    drafts  and    other  temperature

     fluctuations in the dark.

8.    Add   50l    of  Stop    Solution   to   each    well  when    the   first   four  wells

     containing the highest concentration of standards develop obvious blue

     color. If color change does not appear uniform, gently tap the plate to

     ensure thorough mixing.

9.    Determine the optical density of each well within 30 minutes, using a

     microplate reader set to 450 nm.

                                             7

----------------------- Page 8-----------------------

CALCULATION OF RESULTS

Average the duplicate readings for each standard, control, and sample and

subtract the average zero standard optical density. Create a standard curve

by reducing the data using computer software capable of generating a four

parameter logistic （4-PL） curve-fit. As an alternative, construct a standard

curve   by   plotting   the   mean   absorbance   for   each   standard   on   the   y-axis

against the concentration on the x-axis and draw a best fit curve through the

points on the graph. The data may be linearized by plotting the log of the

LEP concentrations versus the log of the O.D. and the best fit line can be

determined       by   regression    analysis.    This   procedure     will  produce     an

adequate but less precise fit of the data. If samples have been diluted, the

concentration      read   from   the  standard    curve   must   be  multiplied    by  the

dilution factor.

LIMITATIONS OF THE PROCEDURE

      The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.

      Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.

      It is important that the Calibrator Diluent selected for the standard curve

     be consistent with the samples being assayed.

      If samples generate values higher than the highest standard, dilute the

     samples with the appropriate Calibrator Diluent and repeat the assay.

      Any   variation    in  Standard     Diluent,   operator,    pipetting   technique,

     washing   technique,   incubation   time   or   temperature,  and   kit   age   can

     cause variation in binding.

      This assay is designed to eliminate interference by soluble receptors,

     binding proteins, and other factors present in biological samples. Until

     all  factors   have   been    tested   in  the  Quantikine     Immunoassay,       the

     possibility of interference cannot be excluded.

                                            8

----------------------- Page 9-----------------------

TECHNICAL HINTS

      Centrifuge vials before opening to collect contents.

      When mixing or reconstituting protein solutions, always avoid foaming.

      To avoid cross-contamination, change pipette tips between additions of

     each standard level, between sample additions, and between reagent

     additions. Also, use separate reservoirs for each reagent.

      When   using   an   automated   plate   washer,   adding   a   30  second   soak

     period   following   the   addition   of   wash   buffer,   and/or   rotating   the   plate

     180 degrees between wash steps may improve assay precision.

      To   ensure   accurate   results,   proper   adhesion   of   plate   sealers   during

     incubation steps is necessary.

      Substrate   Solution   should   remain   colorless   until   added   to   the   plate.

     Keep Substrate Solution protected from light. Substrate Solution should

     change from colorless to gradations of blue.

      Stop Solution should be added to the plate in the  same order as the

     Substrate Solution. The color developed in the wells will turn from blue

     to   yellow   upon   addition   of   the   Stop   Solution. Wells  that   are   green   in

     color indicate that the Stop Solution has not mixed thoroughly with the

     Substrate Solution.

                                             9

----------------------- Page 10-----------------------

                      人瘦素人瘦素（LEP）酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析

                      人瘦素人瘦素           酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析

                          試劑盒使用說明書試劑盒使用說明書

                          試劑盒使用說明書試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

產(chǎn)品編號(hào)產(chǎn)品編號(hào)：：CSB-E04649h

產(chǎn)品編號(hào)產(chǎn)品編號(hào)：：

檢測范圍檢測范圍：：0.32 ng/ml - 20 ng/ml

檢測范圍檢測范圍：：

zui低檢測限zui低檢測限：：0.08 ng/ml

zui低檢測限zui低檢測限：：

特異性特異性：：本試劑盒可同時(shí)檢測天然或重組的人LEP，且與其他相關(guān)蛋白無

特異性特異性：：

交叉反應(yīng)。

有效期有效期：：6 個(gè)月

有效期有效期：：

預(yù)期應(yīng)用預(yù)期應(yīng)用：：ELISA 法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生

預(yù)期應(yīng)用預(yù)期應(yīng)用：：

物液體中LEP 含量。

說明說明：：

說明說明：：

1.  試劑盒保存：-20℃（較長時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。

2.  濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

3.  中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn)。

4.  剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)

    驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。

實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理：：

實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理：：

     用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗LEP 抗體的微孔中

依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、*化的抗LEP 抗體、HRP 標(biāo)記的親和素，經(jīng)過

*洗滌后用底物TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并

在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的LEP 呈正相關(guān)。用

酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度 （OD 值），計(jì)算樣品濃度。

                                      10

----------------------- Page 11-----------------------

試劑盒組成及試劑配制試劑盒組成及試劑配制：：

試劑盒組成及試劑配制試劑盒組成及試劑配制：：

1.  酶聯(lián)酶聯(lián)板板（Assay plate ）：                                      一塊（96 孔）。

    酶聯(lián)酶聯(lián)板板

2.  標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：                                          2 瓶（凍干品）。

    標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品

3.  樣品稀釋液樣品稀釋液（Sample Diluent）：                                  1×20ml/瓶。

    樣品稀釋液樣品稀釋液

4.  *標(biāo)記抗體稀釋液*標(biāo)記抗體稀釋液（（Biotin-antibody Diluent）：）             1×10ml/瓶。

    *標(biāo)記抗體稀釋液*標(biāo)記抗體稀釋液（（                            ））

5.  辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液（（HRP-avidin Diluent）：）  1×10ml/瓶。

    辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液（（                         ））

6.  *標(biāo)記抗體*標(biāo)記抗體（（Biotin-antibody）：）                 1×120l/瓶（1：100）。

    *標(biāo)記抗體*標(biāo)記抗體（（                  ））

7.  辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（（HRP-avidin）：）            1×120l/瓶（1：100）。

    辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（（               ））

8.  底物溶液底物溶液（（TMB Substrate）：）                                   1×10ml/瓶。

    底物溶液底物溶液（（                 ））

9.  濃洗滌液濃洗滌液（（Wash Buffer ）） 1×20ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。

    濃洗滌液濃洗滌液（（               ））

10. 終止液終止液（（Stop Solution）：）                                    1×10ml/瓶 。

    終止液終止液（（               ））

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材：：

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材：：

1.  標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀

2.  高速離心機(jī)

3.  電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.  干凈的試管和Eppendof 管

5.  系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時(shí)，用多通道移液器

6.  蒸餾水，容量瓶等

標(biāo)本的采集及保存標(biāo)本的采集及保存：：

標(biāo)本的采集及保存標(biāo)本的采集及保存：：

1.  血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2 小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g 離心20 分

    鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍

    融。

2.  血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30 分鐘內(nèi)于2 - 8° C

    1000 x g 離心15 分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)

    凍融。

3.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g 離心20 分鐘，取上清即可檢

    測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測結(jié)果標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。。

注注：：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測結(jié)果標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測結(jié)果，，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。。

                                     11

----------------------- Page 12-----------------------

標(biāo)本的稀釋原則標(biāo)本的稀釋原則：：

標(biāo)本的稀釋原則標(biāo)本的稀釋原則：：

首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。

只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)

做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算濃度時(shí)，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：：2 瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：：

后靜置10 分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為20   ng/ml，做

系列倍比稀釋后，分別稀釋20 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml,2.5 ng/ml, 1.25 ng/ml,

0.62 ng/ml, 0.32 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml，臨用前15

分鐘內(nèi)配制。

如配制10   ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml  （不要少于0.5ml）20   ng/ml 的上述標(biāo)準(zhǔn)

品加入含0.5ml 樣品稀釋液的Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此類

推。

*標(biāo)記抗體的稀釋原則*標(biāo)記抗體的稀釋原則：：

*標(biāo)記抗體的稀釋原則*標(biāo)記抗體的稀釋原則：：

臨用前以*標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所

需的總量配制 （每孔100l），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10l 生物

素標(biāo)記抗體加990l *標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用

前一小時(shí)內(nèi)配制。

辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：：

辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：：

臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的

每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100l），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如

10l  辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加 990l  辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋

液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

操作步驟操作步驟：：

操作步驟操作步驟：：

實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r(shí)，均需混勻，混勻

時(shí)盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí)，用樣品

稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

                                      12

----------------------- Page 13-----------------------

1.  加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100l，

    余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100l，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于

    酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，

    37℃反應(yīng)120 分鐘。

    為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.  棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加*標(biāo)記抗體工作液 100l （取1l

    *標(biāo)記抗體加99l *標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，

    在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37℃,60 分鐘。

3.  溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分鐘，

    200l/每孔，甩干。

4.  每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液 （同*標(biāo)記抗體工作液）

    100l，37℃，60 分鐘。

5.  溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分鐘，

    200l/每孔，甩干。

6.  依序每孔加底物溶液90l，37℃避光顯色 （（30 分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)

                                               （（

    準(zhǔn)品的前3-4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4 孔梯度不明顯，即可終止）。

7.  依序每孔加終止溶液50l，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加

    入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底

    物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.  用酶聯(lián)儀在450nm 波長依序測量各孔的光密度 （OD 值）。 在加終止液

    后15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。

實(shí)驗(yàn)備注實(shí)驗(yàn)備注

實(shí)驗(yàn)備注實(shí)驗(yàn)備注

1.  用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到

    管底。

2.  每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶

    液及2N H SO4。測量時(shí)先用此孔調(diào)OD 值至零。

              2

3.  為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上

    蓋或覆膜。

4.  未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、*標(biāo)記抗體

    工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)

    勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、*標(biāo)記抗體工作液、或辣根過氧化物

    酶標(biāo)記親和素工作液。

5.  建議檢測樣品時(shí)均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

                                      13

----------------------- Page 14-----------------------

洗板方法洗板方法：：

洗板方法洗板方法：：

手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上

鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml

注入孔內(nèi)，浸泡1-2 分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。

 自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。

計(jì)算計(jì)算：：

計(jì)算計(jì)算：：

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD 值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)

數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；

再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方

程式，將樣品的OD 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即

為樣品的實(shí)際濃度。

注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)：：

注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)：：

1.  當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

2.  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3.  一次加樣時(shí)間控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4.  請(qǐng)每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。

5.  如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請(qǐng)先稀釋后再測定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋

    倍數(shù)。

6.  在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

7.  底物請(qǐng)避光保存。

8.  不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

                                     14

----------------------- Page 15-----------------------

Notes

                                                                            15

----------------------- Page 16-----------------------

                                                                            16

----------------------- Page 17-----------------------

                                                                            17