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小鼠白介素10（IL-10）ELISA試劑盒

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       Mouse Interleukin 10（IL-10）

                              ELISA Kit

                        Catalog No. CSB-E04594m

                                       （96T）

    This immunoassay kit allows for the in vitro quantitative determination of mouse

    IL-10 concentrations in serum, plasma and other biological fluids.

    Expiration date     six months from the date of manufacture

    FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.

                                           1

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INTRODUCTION

Interleukin-10   （IL-10）, also   known   as human  cytokine   synthesis   inhibitory

factor （CSIF）, is an anti-inflammatory cytokine. This cytokine is produced

primarily     by   monocytes       and    to  a  lesser    extent    by   lymphocytes.      This

cytokine   has   pleiotropic   effects   in   immunoregulation   and   inflammation.   It

down-regulates   the   expression   of   Th1   cytokines,   MHC  class   II   antigens,

and   costimulatory   molecules   on   macrophages.   It   also   enhances   B   cell

survival,   proliferation,   and   antibody   production.   This   cytokine   can   block

NF-κB activity, and is involved in the regulation of the JAK-STAT signaling

pathway. Knockout studies in mice suggested the function of this cytokine

as an essential immunoregulator in the intestinal tract. A study in mice has

shown that interleukin-10 is also produced by mast cells, counteracting the

inflammatory effect that these cells have at the site of an allergic reaction.

PRINCIPLE OF THE ASSAY

The     microtiter    plate   provided    in  this   kit  has   been   pre-coated       with   an

antibody   specific   to   IL-10   Standards   or   samples   are   then   added   to   the

appropriate       microtiter    plate    wells   with    a   biotin-conjugated       polyclonal

antibody       preparation      specific     for   IL-10    and     Avidin    conjugated       to

Horseradish        Peroxidase      （HRP）     is  added     to  each    microplate     well   and

incubated. Then a TMB （3,3'5, 5' tetramethyl-benzidine） substrate solution

is added to each well. Only those wells that contain IL-10, biotin-conjugated

antibody and enzyme-conjugated Avidin will exhibit a change in color. The

enzyme-substrate reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid

solution   and   the   color   change   is   measured   spectrophotometrically   at   a

wavelength of 450 nm ± 2 nm. The concentration of IL-10 in the samples is

then   determined   by   comparing   the   O.D.   of   the   samples   to   the   standard

curve.

                                                2

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DETECTION RANGE

3.2   pg/ml-200    pg/ml.   The   standard   curve   concentrations     used   for  the

ELISA’s   were   200   pg/ml,   100   pg/ml,   50   pg/ml,   25   pg/ml,   12.5   pg/ml,6.2

pg/ml,3.2 pg/ml.

SPECIFICITY

This assay recognizes recombinant and natural mouse IL-10 No significant

cross-reactivity or interference was observed.

SENSITIVITY

The   minimum   detectable   dose   of   mouse   IL-10   is   typically   less   than   0.8

pg/ml.

The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection （LLD） was defined

as the lowest protein concentration that could be differentiated from zero.

MATERIALS PROVIDED

               Reagent                                      Quantity

               Assay plate                                       1

               Standard                                          2

               Sample Diluent                               1 x 20 ml

               Biotin-antibody Diluent                      1 x 10 ml

               HRP-avidin Diluent                           1 x 10 ml

               Biotin-antibody                              1 x 120l

               HRP-avidin                                   1 x 120l

                                                            1 x 20 ml

               Wash Buffer

                                                         （25×concentrate）

               TMB Substrate                                1 x 10 ml

               Stop Solution                                1 x 10 ml

                                           3

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STORAGE

1.   Unopened   test   kits   should   be   stored   at   2-8°C   upon   receipt   and   the

    microtiter plate should be kept in a sealed bag. The test kit may be used

    throughout      the   expiration    date   of   the  kit,  provided    it  is  stored   as

    prescribed above. Refer to the package label for the expiration date.

2.   Opened test plate should be stored at 2-8°C in the aluminum foil bag

    with desiccants to minimize exposure to damp air. The kits will remain

    stable until the expiring date shown, provided it is stored as prescribed

    above.

3.   A   microtiter   plate   reader   with   a   bandwidth   of   10   nm   or   less   and   an

    optical   density   range   of   0-3   OD   or   greater   at   450nm   wavelength   is

    acceptable for use in absorbance measurement.

REAGENT PREPARATION

Bring all reagents to room temperature before use.

1.   Wash Buffer          If crystals have formed in the concentrate, warm up to

     room   temperature   and   mix   gently   until   the   crystals  have   compley

     dissolved. Dilute 20 ml of Wash Buffer Concentrate  into deionized or

     distilled water to prepare 500 ml of Wash Buffer.

2.   Standard        Centrifuge   the   standard   vial   at   6000-10000rpm   for       30s.

     Reconstitute       the Standard       with   1.0   ml   of Sample       Diluent.     This

     reconstitution      produces     a   stock   solution    of  200    pg/ml.   Allow    the

     standard to sit for a minimum of 15 minutes with gentle agitation prior to

     making   serial     dilutions.   The   undiluted    standard     serves   as   the  high

     standard （200 pg/ml）. The Sample Diluent serves as the zero standard

     （0 pg/ml）. Prepare fresh for each assay. Use within 4 hours and discard

     after use.

                                               4

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3.   Biotin-antibody         Centrifuge     the  vial  before   opening.    Dilute   to  the

     working       concentration        using    Biotin-antibody          Diluent（1:100）,

     respectively.

4.   HRP-avidin        Centrifuge the vial before opening. Dilute to the working

     concentration using HRP-avidin Diluent（1:100）, respectively.

Precaution: The Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear

             eye, hand, face, and clothing protection when using this material.

OTHER SUPPLIES REQUIRED

      Microplate   reader   capable   of   measuring   absorbance  at   450   nm,   with

     the correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.

      Pipettes and pipette tips.

      Deionized or distilled water.

      Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer.

      An incubator which can provide stable incubation conditions up to

     37°C±0.5°C.

SAMPLE COLLECTION AND STORAGE

     Serum      Use a serum separator tube （SST） and allow samples to clot

     for 30 minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 g. Remove

     serum and assay immediay or aliquot and store samples at -20°C.

     Centrifuge   the   sample   again   after   thawing   before   the   assay.   Avoid

     repeated freeze-thaw cycles.

     Plasma       Collect     plasma     using   citrate,  EDTA,     or   heparin    as   an

     anticoagulant. Centrifuge for 15 minutes at 1000 g within 30 minutes of

     collection.   Assay   immediay   or   aliquot   and   store  samples   at   -20°C.

     Centrifuge   the   sample   again   after   thawing   before   the   assay.   Avoid

     repeated freeze-thaw cycles.

Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.

                                              5

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ASSAY PROCEDURE

Bring     all  reagents    and    samples     to  room     temperature    before     use.   It  is

recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.

All   the   reagents   should   be   added   directly   to   the   liquid   level   in   the   well.   The

pipette should avoid contacting the inner wall of the well.

 1.   Add   100l   of   Standard,   Blank,   or   Sample   per   well.   Cover   with   the

     adhesive strip. Incubate for 2 hours at 37°C.

 2.   Remove the liquid of each well, don’t wash.

 3.   Add 100l of Biotin-antibody working solution to each well. Incubate

     for   1   hour   at  37°C.   Biotin-antibody   working           solution    may    appear

     cloudy.   Warm   up   to   room   temperature   and   mix   gently  until   solution

     appears uniform.

 4.   Aspirate each well and wash, repeating the process three times for a

     total of three washes. Wash: Fill each well with Wash Buffer （200l） and

     let   it  stand for  2  minutes, then   remove   the   liquid  by flicking  the  plate

     over a sink. The remaining drops are removed by patting the plate on a

     paper   towel.   Complete   removal   of   liquid   at   each   step   is   essential   to

     good performance.

 5.   Add   100l   of  HRP-avidin   working   solution   to   each   well.   Cover   the

     microtiter plate with a new adhesive strip. Incubate for 1 hour at 37°C.

 6.   Repeat the aspiration and wash three times as step 4.

 7.   Add 90l of TMB Substrate to each well. Incubate for 10-30 minutes at

     37°C.     Keeping     the   plate   away     from   drafts    and   other   temperature

     fluctuations in the dark.

 8.   Add    50l    of  Stop    Solution   to     each    well  when     the  first   four  wells

     containing the highest concentration of standards develop obvious blue

     color. If color change does not appear uniform, gently tap the plate to

     ensure thorough mixing.

 9.   Determine the optical density of each well within 30 minutes, using a

     microplate reader set to 450 nm.

                                                6

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CALCULATION OF RESULTS

Using   the   professional   soft   "Curve   Exert   1.3"   to   make   a   standard   curve   is

recommended, which can be downloaded from our web.

Average the duplicate readings for each standard, control, and sample and

subtract the average zero standard optical density. Create a standard curve

by reducing the data using computer software capable of generating a four

parameter logistic （4-PL） curve-fit. As an alternative, construct a standard

curve   by   plotting   the   mean   absorbance   for   each   standard   on   the   y-axis

against the concentration on the x-axis and draw a best fit curve through the

points on the graph. The data may be linearized by plotting the log of the

IL-10 concentrations versus the log of the O.D. and the best fit line can be

determined       by    regression     analysis.    This   procedure      will  produce      an

adequate but less precise fit of the data. If samples have been diluted, the

concentration       read   from   the   standard    curve    must   be  multiplied     by  the

dilution factor.

LIMITATIONS OF THE PROCEDURE

      The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.

      Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.

      It is important that the Standard Diluent selected for the standard curve

     be consistent with the samples being assayed.

      If samples generate values higher than the highest standard, dilute the

     samples with the appropriate Standard Diluent and repeat the assay.

      Any    variation    in  Standard      Diluent,    operator,    pipetting    technique,

     washing   technique,   incubation   time   or   temperature,  and   kit   age   can

     cause variation in binding.

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      This assay is designed to eliminate interference by soluble receptors,

     binding proteins, and other factors present in biological samples. Until

     all   factors   have   been   tested   in   the   Immunoassay,   the   possibility   of

     interference cannot be excluded.

TECHNICAL HINTS

      Centrifuge vials before opening to collect contents.

      When mixing or reconstituting protein solutions, always avoid foaming.

      To avoid cross-contamination, change pipette tips between additions of

     each standard level, between sample additions, and between reagent

     additions. Also, use separate reservoirs for each reagent.

      When   using   an   automated   plate   washer,   adding   a   30  second   soak

     period   following   the   addition   of   wash   buffer,   and/or   rotating   the   plate

     180 degrees between wash steps may improve assay precision.

      To   ensure   accurate   results,   proper   adhesion   of   plate   sealers   during

     incubation steps is necessary.

      Substrate Solution should remain colorless or light blue until added to

     the    plate.   Keep    Substrate     Solution    protected     from    light.  Substrate

     Solution   should   change   from   colorless   or   light   blue   to   gradations   of

     blue.

      Stop Solution should be added to the plate in the  same order as the

     Substrate Solution. The color developed in the wells will turn from blue

     to   yellow   upon   addition   of   the   Stop   Solution. Wells  that   are   green   in

     color indicate that the Stop Solution has not mixed thoroughly with the

     Substrate Solution.

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                 小鼠小鼠白介素白介素10（IL-10）酶聯免疫分析酶聯免疫分析

                 小鼠小鼠白介素白介素                   酶聯免疫分析酶聯免疫分析

                           試劑盒使用說明書試劑盒使用說明書

                           試劑盒使用說明書試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

產品編號產品編號：：CSB-E04594m

產品編號產品編號：：

檢測范圍檢測范圍：：3.2 pg/ml-200 pg/ml,

檢測范圍檢測范圍：：

zui低檢測zui低檢測限：限：0.8 pg/ml

zui低檢測zui低檢測限限：：

特異性特異性：：本試劑盒可同時檢測天然或重組的小鼠 IL-10，且與其他相關蛋

特異性特異性：：

白無交叉反應。

有效期有效期：：6 個月

有效期有效期：：

預期應用預期應用：：ELISA 法定量測定小鼠血清、血漿、細胞培養上清或其它相關

預期應用預期應用：：

生物液體中IL-10 含量。

說明說明

說明說明

1   試劑盒保存：未開封的試劑盒應儲存于2-8℃；開封后的酶標板應與干燥

    劑一起儲存于鋁箔袋中置于2-8℃保存。僅在此出儲存條件下，產品在有

    效期內可正常使用。

2   濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

3   中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。

4   剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實

    驗結果造成任何影響。

實驗原理實驗原理

實驗原理實驗原理

     用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗IL-10 抗體的微孔中

依次加入標本或標準品、*化的抗IL-10 抗體、HRP 標記的親和素，經

過*洗滌后用底物TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，

并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-10 呈正相關。

用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度 （OD 值），計算樣品濃度。

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試劑盒組成及試劑配制試劑盒組成及試劑配制

試劑盒組成及試劑配制試劑盒組成及試劑配制

1.  酶聯板酶聯板（Assay plate ）：                                      一塊（96 孔）。

    酶聯板酶聯板

2.  標準品標準品（Standard）：                                          2 瓶（凍干品）。

    標準品標準品

3.  樣品稀釋液樣品稀釋液（Sample Diluent）：                                  1×20ml/瓶。

    樣品稀釋液樣品稀釋液

4.  *標記抗體稀釋液*標記抗體稀釋液（（Biotin-antibody Diluent）：）             1×10ml/瓶。

    *標記抗體稀釋液*標記抗體稀釋液（（                            ））

5.  辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液（（HRP-avidin Diluent）） 1×10ml/瓶。

    辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液（（                         ））

6.  *標*標記抗體記抗體（（Biotin-antibody）：）                 1×120l/瓶（1：100）。

    *標*標記抗體記抗體（（                  ））

7.  辣根過氧化物酶標記親和素辣根過氧化物酶標記親和素（（HRP-avidin）：）            1×120l/瓶（1：100）。

    辣根過氧化物酶標記親和素辣根過氧化物酶標記親和素（（                ））

8.  底物溶液底物溶液（（TMB Substrate）：）                                   1×10ml/瓶。

    底物溶液底物溶液（（                 ））

9.  濃洗滌液濃洗滌液（（Wash Buffer ）） 1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。

    濃洗滌液濃洗滌液（（               ））

10. 終止液終止液（（Stop Solution）：）                                     1×10ml/瓶。

    終止液終止液（（                ））

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材

1.  標準規格酶標儀

2.  高速離心機

3.  電熱恒溫培養箱

4.  干凈的試管和Eppendof 管

5.  系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器

6.  蒸餾水，容量瓶等

標本的采集及保存標本的采集及保存

標本的采集及保存標本的采集及保存

1.  血清：全血標本請于室溫放置2 小時或4℃過夜后于1000g 離心20 分鐘，

    取上清即可立即檢測；或進行分裝，并將標本放于-20℃或-80℃保存，但

    應避免反復凍融。解凍后的樣品應再次離心，然后檢測。

2.  血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后30 分鐘內于2   -   8°C

    1000 g 離心15 分鐘，取上清即可立即檢測；或進行分裝，并將標本放于

    -20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。解凍后的樣品應再次離心，然后

    檢測。

注：注：標本溶血會影響zui后檢測結果標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測，因此溶血標本不宜進行此項檢測。。

注注：：標本溶血會影響zui后檢測結果標本溶血會影響zui后檢測結果，，因此溶血標本不宜進行此項檢測因此溶血標本不宜進行此項檢測。。

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標準品的稀釋原則標準品的稀釋原則：：2 瓶，使用前于6000-10000rpm 離心30 秒。每

標準品的稀釋原則標準品的稀釋原則：：

瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10 分鐘以上，然后反復顛倒

/搓動以助溶解，其濃度為200 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋200 pg/ml,

100 pg/ml, 50 pg/ml, 25 pg/ml, 12.5 pg/ml,6.2 pg/ml,3.2 pg/ml，樣品稀釋液

直接作為標準濃度0   pg/ml，臨用前15 分鐘內配制，用完丟棄，下次檢測使

用新鮮配置的標準品。

如配制100   pg/ml 標準品：取0.5ml  （不要少于0.5ml）200   pg/ml 的上述標

準品加入含0.5ml 樣品稀釋液的Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此

類推。

*標記抗體的稀釋原則*標記抗體的稀釋原則：：

*標記抗體的稀釋原則*標記抗體的稀釋原則：：

打開瓶蓋前請離心，收集瓶壁上的溶液。臨用前以*標記抗體稀釋液稀

釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制 （每孔100l），實際

配制時應多配制0.1-0.2ml。如10l *標記抗體加990l *標記抗體

稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。

辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：：

辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：：

打開瓶蓋前請離心，收集瓶壁上的溶液。臨用前以辣根過氧化物酶標記親和

素稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔

100l），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10l 辣根過氧化物酶標記親和素

加990l 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用

前一小時內配制。

操作步驟操作步驟

操作步驟操作步驟

實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻

時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品

稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。加樣時，槍頭應直接對

準液面，切勿沿孔壁加樣。

1   加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100l，

    余孔分別加標準品或待測樣品100l，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于

    酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，

    37℃反應120 分鐘。

    為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

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2   棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加*標記抗體工作液 100l （取1l

    *標記抗體加99l *標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，

    在使用前一小時內配制），37℃,60 分鐘。

3   溫育60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分鐘，

    200l/每孔，甩干。

4   每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液 （同*標記抗體工作液）

    100l，37℃，60 分鐘。

5   溫育60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分鐘，

    200l/每孔，甩干。

6   依序每孔加底物溶液90l，37℃避光顯色（（30 分鐘內，此時肉眼可見標

                                                （（

    準品的前3-4 孔有明顯的梯度藍色，后3-4 孔顯色不明顯，即可終止）。

7   依序每孔加終止溶液50l，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加

    入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底

    物反應時間到后應盡快加入終止液。

8   用酶聯儀在450nm 波長依序測量各孔的光密度 （OD 值）。 在加終止液

    后15 分鐘以內進行檢測。

實驗備注實驗備注

實驗備注實驗備注

1.  用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到

    管底。

2.  每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶

    液及終止液。測量時先用此孔調OD 值至零。

3.  為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上

    蓋或覆膜。

4.  未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、*標記抗體

    工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據所需的量配置使用。請

    勿重復使用已稀釋過的標準品、*標記抗體工作液、或辣根過氧化物

    酶標記親和素工作液。

5.  建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。

洗板方法洗板方法

洗板方法洗板方法

手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上

鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml

注入孔內，浸泡1-2 分鐘。根據需要，重復此過程數次。

 自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

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計算計算

計算計算

請從我們的下載專業軟件"Curve Exert 1.3"，并根據提示制作標準曲線。

以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD 值為縱坐標（普通坐標），在半對

數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；

再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方

程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即

為樣品的實際濃度。

注意事項注意事項

注意事項注意事項

1.  本操作說明適用于本操作說明適用于48T 試劑盒試劑盒，， 48T 試劑盒中試劑盒中酶聯板酶聯板、標準品、標準品、*、*

    本操作說明適用于本操作說明適用于        試劑盒試劑盒，，      試劑盒中試劑盒中酶聯板酶聯板、、標準品標準品、、**

    標記抗體及辣根過氧化物酶標記親和素減半標記抗體及辣根過氧化物酶標記親和素減半。。

    標記抗體及辣根過氧化物酶標記親和素減半標記抗體及辣根過氧化物酶標記親和素減半。。

2.  當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。

3.  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

4.  一次加樣時間控制在5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

5.  請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。

6.  如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋

    倍數。

7.  在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

8.  底物請避光保存。

9.  不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

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Notes

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