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  Human C-Reactive
Protein,CRP  
ELISA Kit 
 
 
 
Catalog No. CSB-E07921h
（96 T）
 
 
 
 
 
  This immunoassay kit allows for the in vitro quantitative determination of human
CRP concentrations in serum, plasma and other biological fluids.
  Expiration date      six months from the date of manufacture
  FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.
 
 
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INTRODUCTION
C-reactive  protein  （CRP）  is  a  protein  found  in  the  blood  in  response    to  
inflammation  （an acute-phase protein）. CRP  is synthesized by  the  liver  in
response to factors released by fat cells （adipocytes）. It is a member of the
pentraxin family of proteins. CRP is a member of the class of acute-phase
reactants  as  its  levels  rise  dramatically  during  inflammatory  processes
occurring  in  the  body.  This  increment  is  due  to  a  rise  in  the  plasma
concentration of    IL-6, which  is produced predominantly by macrophages
as  well  as  adipocytes.  CRP  binds  to  phosphocholine  on  microbes.  It  is
thought to assist in complement binding to foreign and damaged cells and
enhances  phagocytosis  by  macrophages,  which  express  a  receptor  for
CRP. It is also believed to play another important role in innate immunity, as
an early defense system against infections. CRP rises up to 50,000-fold in
acute  inflammation, such as  infection.  It rises above normal  limits within 6
hours, and peaks at 48 hours. Its half-life    is constant, and    therefore    its
level is mainly determined by the rate of production （and hence the severity
of  the  precipitating  cause）.  Serum  amyloid  A  is  a  related    acute-phase
marker that responds rapidly in similar circumstances. To measure the CRP
level, a  "high-sensitivity" CRP or hs-CRP  test needs  to be performed and
analyzed  by  a  laboratory.  This  is  an  automated  blood    test  designed  for
greater  accuracy  in  measuring  low  levels  of  CRP,  which  allows  the
physician to assess cardiovascular risk.  
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The  microtiter  plate  provided  in  this  kit  has  been  pre-coated  with  an 
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antibody  specific  to  CRP.  Standards  or  samples  are  then  added  to  the
appropriate  microtiter  plate  wells  with  a  HRP-conjugated  antibody
preparation specific for CRP to each microplate well and incubated. Then a
TMB  （3,3',5,5'  tetramethyl-benzidine）  substrate  solution  is  added  to  each
well.  Only  those  wells  that  contain  CRP,  HRP-conjugated  antibody  will
exhibit a change  in color. The enzyme-substrate reaction  is  terminated by
the addition of a sulphuric acid solution and the color change is measured
spectrophotometrically  at  a  wavelength  of  450  nm  ±  2  nm.  The
concentration of CRP in the samples is then determined by comparing the
O.D. of the samples to the standard curve.
DETECTION RANGE
0.625  ng/ml-40  ng/ml.  The  standard  curve  concentrations  used  for  the
ELISA’s were 40 ng/ml, 20 ng/ml, 10 ng/ml,5 ng/ml, 2.5 ng/ml, 1.25 ng/ml,
0.625ng/ml.
SPECIFICITY
This assay recognizes recombinant and natural human CRP. No significant
cross-reactivity or interference was observed.
SENSITIVITY
The minimum detectable dose of human CRP  is  typically  less  than 0.156
ng/ml.
The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection （LLD） was defined
as the lowest protein concentration that could be differentiated from zero. 
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MATERIALS PROVIDED
Reagent      Quantity
Assay plate  1
Standard  2
Sample Diluent      4 x 20 ml
HRP-conjugate Diluent      1 x 10 ml
HRP-conjugate    1 x 120µl
Wash Buffer      
1 x 20 ml
（25×concentrate）
TMB Substrate      1 x 10 ml
Stop Solution      1 x 10 ml
STORAGE
1.  Unopened  test  kits  should  be  stored  at  2-8°C  upon  receipt  and  the
microtiter  plate  should  be  kept  in  a  sealed  bag  with  desiccants  to
minimize exposure to damp air. The test kit may be used throughout the
expiration date of  the kit. Refer  to  the package  label  for  the expiration
date.
2.  A  microtiter  plate  reader  with  a  bandwidth  of  10  nm  or  less  and  an
optical  density  range  of  0-3  OD  or  greater  at  450nm  wavelength  is
acceptable for use in absorbance measurement.
REAGENT PREPARATION
Bring all reagents to room temperature before use for 30min.  
1.  Wash Buffer    If crystals have  formed  in  the concentrate, warm up  to
room  temperature  and  mix  gently  until  the  crystals  have  compley
dissolved. Dilute 20 ml of Wash Buffer Concentrate  into deionized or
distilled water to prepare 500 ml of Wash Buffer. 
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2.  Standard    Centrifuge  the  standard  vial  at  6000-10000rpm  for  30s.
Reconstitute  the  Standard  with  1.0  ml  of  Sample  Diluent.  This
reconstitution produces a stock solution of 40 ng/ml. Allow the standard
to sit for a minimum of 15 minutes with gentle agitation prior to making
serial dilutions. The undiluted standard serves as the high standard （40
ng/ml）.  The  Sample  Diluent  serves  as  the  zero  standard  （0  ng/ml）.
Prepare fresh for each assay. Use within 4 hours and discard after use.
3.  HRP-conjugate    Dilute  to  the  working  concentration  using
HRP-conjugate Diluent（1:100）,  respectively. The  suggested  100-fold
dilution can be achieved by adding 10 uL HRP-conjugate  to 990uL of
HRP-conjugate Diluent for 1ml working solution.
OTHER SUPPLIES REQUIRED
  Microplate  reader  capable  of measuring  absorbance  at  450  nm, with
the correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.
  Pipettes and pipette tips.
  Deionized or distilled water.
  Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer.
SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
  Serum    Use a serum separator  tube （SST） and allow samples  to clot
for 30 minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 x g. Remove
serum and assay  immediay or aliquot and store samples at  -20° C.
Avoid repeated freeze-thaw cycles. 
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  Plasma    Collect  plasma  using  citrate,  EDTA,  or  heparin  as  an
anticoagulant. Centrifuge for 15 minutes at 1000 x g within 30 minutes
of collection. Assay  immediay or aliquot and store samples at-20°C.
Avoid repeated freeze-thaw cycles.
Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.
If samples generate values higher than the highest standard, dilute the samples
with the Sample Diluent and repeat the assay.
SAMPLE PREPARTION
Normal human serum samples  require a 1000-fold dilution  into Sample
Diluent. The  suggested 1000-fold dilution  can be achieved by adding 5µl
sample  to  95µl  of  Sample  Diluent.  Complete  the  1000-fold  dilution  by
adding 5µl of  this solution  to 245µl of Sample Diluent. The  recommended
dilution  factor  is  for  reference  only.  The  optimal  dilution  factor  should  be
determined by users according to their particular experiments.
As  CRP  levels  increase  widely,  the  patient  serum  samples  are
recommended  to  dilute  1:1000-1:30000  times  before  test.  The
recommended  dilution  factor  is  for  reference  only.  The  optimal  dilution
factor  should  be  determined  by  users  according  to  their  particular
experiments.
ASSAY PROCEDURE
Bring  all  reagents  and  samples  to  room  temperature  before  use.  It  is
recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.
All  the  reagents  should  be  added  directly  to  the  liquid  level  in  the well.  The
pipette should avoid contacting the inner wall of the well. 
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1.  Add 100µl Sample Diluent serves as  the zero standard, Add 100µl of
Standard or Sample per well. Cover with the adhesive strip. Incubate for
60min at 37°C.  
2.  Aspirate each well and wash,  repeating  the process  three  times  for a
total of three washes. Wash by filling each well with Wash Buffer （200µl）
using  a  squirt  bottle,  multi-channel  pipette,  manifold  dispenser  or
autowasher.  Complete  removal  of  liquid  at  each  step  is  essential  to
good  performance. After  the  last wash,  remove  any  remaining Wash
Buffer  by  aspirating  or  decanting.  Invert  the  plate  and  blot  it  against
clean paper towels.
3.  Add 100µl of HRP-conjugate working solution  to each well.  Incubate
for 60min at 37°C.  HRP-conjugate working solution may appear cloudy.
Warm  up  to  room  temperature  and mix  gently  until  solution  appears
uniform.
4.  Repeat the aspiration and wash five times as before.
5.  Add 90µl of TMB Substrate  to each well.  Incubate  for 20 minutes at
37°C.  Keeping  the  plate  away  from  drafts  and  other  temperature
fluctuations in the dark.  
6.  Add  50µl  of  Stop  Solution  to  each  well  when  the  first  four  wells
containing the highest concentration of standards develop obvious blue
color.  If color change does not appear uniform, gently  tap  the plate  to
ensure thorough mixing.
7.  Determine  the optical density of each well within 30 minutes, using a
microplate reader set to 450 nm.
CALCULATION OF RESULTS
Using  the  professional  soft  "Curve  Exert  1.3"  to  make  a  standard  curve  is
recommended, which can be downloaded from our web. 
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Average the duplicate readings for each standard, control, and sample and
subtract the average zero standard optical density. Create a standard curve
by reducing the data using computer software capable of generating a four
parameter  logistic  （4-PL） curve-fit. As an alternative, construct a standard
curve  by  plotting  the mean  absorbance  for  each  standard  on  the  y-axis
against the concentration on the x-axis and draw a best fit curve through the
points on  the graph. The data may be  linearized by plotting  the  log of  the
CRP concentrations versus the log of the O.D. and the best fit line can be
determined  by  regression  analysis.  This  procedure  will  produce  an
adequate but less precise fit of the data. If samples have been diluted, the
concentration  read  from  the  standard  curve  must  be  multiplied  by  the
dilution factor.
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
  The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.
  Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.
  Any  variation  in  operator,  pipetting  technique,  washing  technique,
incubation  time  or  temperature,  and  kit  age  can  cause  variation  in
binding.
  This assay  is designed  to eliminate  interference by soluble  receptors,
binding proteins, and other  factors present  in biological samples. Until
all  factors  have  been  tested  in  the  Immunoassay,  the  possibility  of
interference cannot be excluded.
TECHNICAL HINTS
  When mixing or reconstituting protein solutions, always avoid foaming. 
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  To avoid cross-contamination, change pipette tips between additions of
each standard  level, between sample additions, and between  reagent
additions. Also, use separate reservoirs for each reagent.
  When  using  an  automated  plate  washer,  adding  a  30  second  soak
period  following  the  addition  of wash  buffer,  and/or  rotating  the  plate
180 degrees between wash steps may improve assay precision.
  To  ensure  accurate  results,  proper  adhesion  of  plate  sealers  during
incubation steps is necessary.
  Substrate  Solution  should  remain  colorless  until  added  to  the  plate.
Keep Substrate Solution protected from light. Substrate Solution should
change from colorless to gradations of blue.
  Stop Solution  should be added  to  the plate  in  the  same order as  the
Substrate Solution. The color developed in the wells will turn from blue
to  yellow  upon  addition  of  the Stop Solution. Wells  that  are  green  in
color indicate that the Stop Solution has not mixed thoroughly with the
Substrate Solution.
 
 
 
 
 
 
 
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人 人人 人 C 反應蛋白 反應蛋白 反應蛋白 反應蛋白（CRP）酶聯免疫分析 酶聯免疫分析 酶聯免疫分析 酶聯免疫分析
試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用
產品編號 產品編號 產品編號 產品編號： ：： ：CSB-E07921h
檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍： ：： ：0.625 ng/ml – 40 ng /ml
zui低檢測限 zui低檢測限 zui低檢測限 zui低檢測限： ：： ：0.156 ng/ml
特異性 特異性 特異性 特異性： ：： ：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人 CRP，且與其他相關蛋白無
交叉反應。
有效期 有效期 有效期 有效期： ：： ：6 個月
預期應用 預期應用 預期應用 預期應用： ：： ：ELISA法定量測定人血清、血漿中 CRP 含量。
說明 說明 說明 說明  
1.  試劑盒保存：  2-8℃。
2.  中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
3.  剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實
驗結果造成任何影響。
實驗原理 實驗原理 實驗原理 實驗原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗 CRP 抗體的微孔中
加入標本或標準品、HRP 標記的抗 CRP 抗體，經過*洗滌后用底物顯色。
底物在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。
顏色的深淺和樣品中的 CRP 呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光
度（OD值），計算樣品濃度。   
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試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制  
1.  酶聯板 酶聯板 酶聯板 酶聯板（Assay plate ）：                                                              一塊 （96孔）。   
2.  標準品 標準品 標準品 標準品 （Standard）：                                                                   2 瓶（凍干品）。 
3.  酶結合物 酶結合物 酶結合物 酶結合物（ （（ （HRP-conjugate） ）） ） :                                                  1 x 120µl /瓶。 
4.  酶結合物稀釋液 酶結合物稀釋液 酶結合物稀釋液 酶結合物稀釋液（HRP-conjugate Diluent） :                            1×10ml/瓶。
5.  樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液（Sample Diluent）：                                                     1×20ml/瓶。 
6.  底物溶液 底物溶液 底物溶液 底物溶液 （ （（ （TMB Substrate） ）） ）：                                                       1×10ml/瓶。   
7.  濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液（ （（ （Wash Buffer） ）） ）  1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋 25 倍。 
8.  終止液 終止液 終止液 終止液（ （（ （Stop Solution） ）） ）：                                                            1×10ml/瓶。 
需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材
1.  標準規格酶標儀
2.  高速離心機
3.  電熱恒溫培養箱
4.  干凈的試管和 Eppendof 管
5.  系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6.  蒸餾水，容量瓶等
標本的采集及保存 標本的采集及保存 標本的采集及保存 標本的采集及保存  
1.  血清：全血標本請于室溫放置 2 小時或 4℃過夜后于 1000 x g離心 20 分
鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍
融。
2.  血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后 30 分鐘內于 2 - 8° C
1000 x g離心 15 分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復
凍融。
注 注注 注： ：： ：標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果， ，， ，因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測。 。。 。 
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樣本稀釋倍數 樣本稀釋倍數 樣本稀釋倍數 樣本稀釋倍數
正常人血清推薦 1:1000 倍稀釋后用于檢測。具體操作如下：取 5µl 樣本加入
到 95µl 的*（1:20 稀釋）中混勻，再從上述稀釋液中取 5µl加入到
245µl * （1:50 稀釋）中混勻。得到的即為 1:1000 倍稀釋后的樣本。
此推薦稀釋倍數僅供參考，用戶應根據實驗自行確定其*稀釋倍數。
因發病時 CRP 含量有不同程度增高，推薦對病人血清進行 1:1000-1:30000
倍稀釋。各實驗室應當通過預實驗確定zui合適的稀釋倍數。
標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則： ：： ：2 瓶，使用前于 6000-10000rpm 離心 30 秒。 每
瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至 1ml，蓋好后靜置 10 分鐘以上，然后反復顛倒
/搓動以助溶解，其濃度為 40ng/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋 40 ng/ml,
20 ng/ml, 10 ng/ml,5 ng/ml, 2.5 ng/ml, 1.25 ng/ml, 0.625 ng/ml，樣品稀釋液
直接作為標準濃度 0  ng/ml，臨用前 15 分鐘內配制，用完丟棄，下次檢測使
用新鮮配置的標準品。
如配制 20ng/ml 標準品：取 0.5ml（不要少于 0.5ml）40ng/ml 的上述標準品
加入含 0.5ml樣品稀釋液的 Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此類推。 
酶結合 酶結合 酶結合 酶結合物 物物 物的稀釋原則 的稀釋原則 的稀釋原則 的稀釋原則： ：： ：
打開瓶蓋前請離心，收集瓶壁上的溶液。臨用前用酶結合物稀釋液 酶結合物稀釋液 酶結合物稀釋液 酶結合物稀釋液稀釋，稀
釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔 100µl），實際配制時
應多配制 0.1-0.2ml。如 10µl 酶結合物 酶結合物 酶結合物 酶結合物加990µl 酶結合物稀釋液 酶結合物稀釋液 酶結合物稀釋液 酶結合物稀釋液 的比例配制，
輕輕混勻，在使用前一小時內配制。
操作步驟 操作步驟 操作步驟 操作步驟
實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻
時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品
稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。 
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1.  加樣：分別設標準孔、待測樣品孔。加 100µl 樣品稀釋液作為標準品 S0
孔。余孔分別加標準品或待測樣品 100µl，注意不要有氣泡，加樣將樣品
加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆
膜，37℃反應 60 分鐘。
2.  溫育后，棄去孔內液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，200µl/
每孔，甩干， zui后用力在洗水紙上拍干。
3.  每孔加酶結合物 100µl，空白孔不加。混勻，37℃，60 分鐘。
4.  溫育后，棄去孔內液體，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2 分鐘，200µl/
每孔，甩干，zui后用力在洗水紙上拍干。
5.  依序每孔加底物溶液 90µl，37℃避光顯色20分鐘。
6.  依序每孔加終止溶液 50µl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加
入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底
物反應時間到后應盡快加入終止液。
7.  用酶聯儀在 450nm 波長依序測量各孔的光密度（OD 值）。 在加終止液
后 15 分鐘以內進行檢測。
實驗備注 實驗備注 實驗備注 實驗備注
1.  用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到
管底。
2.  每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶
液及終止液。測量時先用此孔調 OD值至零。  
3.  為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上
蓋或覆膜。
4.  未使用完的酶標板或者試劑，請于 2-8℃保存。
5.  建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
洗板方法 洗板方法 洗板方法 洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上
鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少 0.3ml
注入孔內，浸泡 1-2 分鐘。根據需要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。 
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計算 計算 計算 計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對
數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的 OD 值由標準曲線查出相應的濃度；
再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標準曲線的直線回歸方
程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即
為樣品的實際濃度。  
注意事項 注意事項 注意事項 注意事項
1.  當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。
2.  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3.  一次加樣時間控制在 5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。 
4.  請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
5.  如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋
倍數。
6.  底物請避光保存。
7.  不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。