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Rabbit Interleukin 1 （IL-1）
ELISA Kit
 
Catalog No. CSB-E06896Rb
（96 T）
 
 
  This  immunoassay kit allows  for  the  in vitro quantitative determination of  rabbit
IL-1  concentrations  in  cell  culture  supernates,  serum,  plasma  and  other
biological fluids.
  Expiration date      six months from the date of manufacture
  FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES. 
 
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INTRODUCTION
Interleukin-1  （IL-1）  is  one  of  the  first  cytokines  ever  described.  Its  initial
discovery  was  as  a  factor  that  could  induce  fever,  control  lymphocytes,
increase the number of bone marrow cells and cause degeneration of bone
joints. At  this  time,  IL-1 was  known  under  several  other  names  includipg
endogenous  pyrogen,  lymphocyte  activatipg  factor,  haemopoetin-1  and
mononuclear  cell  factor,  amopgst  others.  IL-1  classically  refers  to  a  17
kilodalton  （kDa）  polypeptide  existipg  in  two  distinct  isoforms,  IL-1α  and
IL-1β,  although  other  members  of  the  IL-1  family  have  recently  been
proposed  .  Although  IL-1α  and  IL-1β  are  encoded  by  separate  genes
sharipg some sequence homology,  they elicit similar biological actions.  In
addition  to  these  two  IL-1  receptor  agonists,  a  native  IL-1  receptor
antagonist  （IL-1ra）  also  maps  to  the  IL-1  gene  cluster  on  human
chromosome  two. All  three proteins are produced as precursors, of which
pro-IL-1α  and  pro-IL-1ra  possess  biological  activity.  Pro-IL-1β,  however,
requires cleavage by caspase-1 （IL-1β convertipg enzyme, ICE） to become
biologically active.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The  microtiter  plate  provided  in  this  kit  has  been  pre-coated  with  an
antibody  specific  to  IL-1.  Standards  or  samples  are  then  added  to  the
appropriate  microtiter  plate  wells  with  a  biotin-conjugated  polyclonal
antibody preparation specific for IL-1 and Avidin conjugated to Horseradish 
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Peroxidase （HRP） is added to each microplate well and incubated. Then a
TMB  （3,3',5, 5'  tetramethyl-benzidine） substrate solution  is added  to each
well.  Only  those  wells  that  contain  IL-1,  biotin-conjugated  antibody  and
enzyme-conjugated  Avidin  will  exhibit  a  chapge  in  color.  The
enzyme-substrate reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid
solution  and  the  color  chapge  is  measured  spectrophotometrically  at  a
wavelepgth of 450 nm ± 2 nm. The concentration of IL-1 in the samples is
then  determined  by  comparipg  the O.D.  of  the  samples  to  the  standard
curve.
DETECTION RAPGE
15.6  pg/ml-1000  pg/ml.  The  standard  curve  concentrations  used  for  the
ELISA’s were  1000  pg/ml,  500  pg/ml,  250  pg/ml,  125  pg/ml,  62.5  pg/ml,
31.2 pg/ml, 15.6 pg/ml.
SPECIFICITY
This assay  recognizes  recombinant and natural  rabbit  IL-1. No significant
cross-reactivity or interference was observed.
SENSITIVITY
The minimum detectable dose of rabbit IL-1 is typically less than 3.9 pg/ml.
The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection （LLD） was defined
as the lowest protein concentration that could be differentiated from zero. 
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MATERIALS PROVIDED
Reagent      Quantity
Assay plate  1
Standard  2
Sample Diluent      1 x 20 ml
Biotin-antibody Diluent      1 x 10 ml
HRP-avidin Diluent        1 x 10 ml
Biotin-antibody      1 x 120l
HRP-avidin  1 x 120l
Wash Buffer      
1 x 20 ml
  （25×concentrate）
TMB Substrate      1 x 10 ml
Stop Solution      1 x 10 ml
STORAGE
1.  Unopened  test  kits  should  be  stored  at  2-8°C  upon  receipt  and  the
microtiter  plate  should  be  kept  in  a  sealed  bag  with  desiccants  to
minimize exposure to damp air. The test kit may be used throughout the
expiration date of  the kit. Refer  to  the package  label  for  the expiration
date.
2.  Opened  test  kits  will  remain  stable  until  the  expiripg  date  shown,
provided it is stored as prescribed above.    
3.  A  microtiter  plate  reader  with  a  bandwidth  of  10  nm  or  less  and  an
optical  density  rapge  of  0-3  OD  or  greater  at  450nm  wavelepgth  is
acceptable for use in absorbance measurement. 
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REAGENT PREPARATION
Bripg all reagents to room temperature before use.  
1.  Wash Buffer    If crystals have  formed  in  the concentrate, warm up  to
room  temperature  and  mix  gently  until  the  crystals  have  compley
dissolved. Dilute 20 ml of Wash Buffer Concentrate  into deionized or
distilled water to prepare 500 ml of Wash Buffer.
2.  Standard    Reconstitute the Standard with 1.0 ml of Sample Diluent.
This  reconstitution produces a stock solution of 1000 pg/ml. Allow  the
standard to sit for a minimum of 15 minutes with gentle agitation prior to
makipg  serial  dilutions.  The  undiluted  standard  serves  as  the  high
standard  （1000  pg/ml）.  The  Sample  Diluent  serves  as  the  zero
standard （0 pg/ml）.
3.  Biotin-antibody    Dilute  to  the workipg concentration specified on  the
vial label usipg Biotin-antibody Diluent（1:100）, respectively.
4.  HRP-avidin    Dilute  to  the workipg concentration specified on  the vial
label usipg HRP-avidin Diluent（1:100）, respectively.
Precaution: The Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear
eye, hand, face, and clothipg protection when usipg this material.
OTHER SUPPLIES REQUIRED
  Microplate  reader  capable  of measuripg  absorbance  at  450  nm, with
the correction wavelepgth set at 540 nm or 570 nm.
  Pipettes and pipette tips.
  Deionized or distilled water.
  Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer. 
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SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
  Cell Culture Supernates    Remove particulates by centrifugation and
assay immediay or aliquot and store samples at -20° C. Avoid
repeated freeze-thaw cycles.
  Serum    Use a serum separator  tube （SST） and allow samples  to clot
for 30 minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 x g. Remove
serum and assay  immediay or aliquot and store samples at  -20° C.
Avoid repeated freeze-thaw cycles.
  Plasma    Collect plasma usipg citrate, EDTA, or heparin as an
anticoagulant. Centrifuge for 15 minutes at 1000 x g within 30 minutes
of collection. Assay immediay or aliquot and store samples at -20°C.
Avoid repeated freeze-thaw cycles.
Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.
ASSAY PROCEDURE
Bripg all reagents and samples to room temperature before use. It is
recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.
1.  Add  100l  of  Standard,  Blank,  or  Sample  per  well.  Cover  with  the
adhesive strip. Incubate for 2 hours at 37° C.  
2.  Remove the liquid of each well, don’t wash.  
3.  Add 100l of Biotin-antibody workipg solution  to each well.  Incubate
for  1  hour  at  37°C.  Biotin-antibody  workipg  solution  may  appear
cloudy. Warm  up  to  room  temperature  and  mix  gently  until  solution
appears uniform. 
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4.  Aspirate each well and wash,  repeatipg  the process  three  times  for a
total of three washes. Wash by fillipg each well with Wash Buffer （200l）
usipg  a  squirt  bottle,  multi-channel  pipette,  manifold  dispenser  or
autowasher.  Complete  removal  of  liquid  at  each  step  is  essential  to
good  performance. After  the  last wash,  remove  any  remainipg Wash
Buffer  by  aspiratipg  or  decantipg.  Invert  the  plate  and  blot  it  against
clean paper towels.
5.  Add  100l  of  HRP-avidin  workipg  solution  to  each  well.  Cover  the
microtiter plate with a new adhesive strip. Incubate for 1 hour at 37° C.
6.  Repeat the aspiration and wash three times as step 4.
7.  Add 90l of TMB Substrate  to each well.  Incubate  for 30 minutes at
37°C.  Keepipg  the  plate  away  from  drafts  and  other  temperature
fluctuations in the dark.
8.  Add  50l  of  Stop  Solution  to  each  well.  If  color  chapge  does  not
appear uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixipg.
9.  Determine  the optical density of each well within 30 minutes, usipg a
microplate reader set to 450 nm.
CALCULATION OF RESULTS
Average the duplicate readipgs for each standard, control, and sample and
subtract the average zero standard optical density. Create a standard curve
by reducipg the data usipg computer software capable of generatipg a four
parameter  logistic  （4-PL） curve-fit. As an alternative, construct a standard 
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curve  by  plottipg  the mean  absorbance  for  each  standard  on  the  y-axis
against the concentration on the x-axis and draw a best fit curve through the
points on  the graph. The data may be  linearized by plottipg  the  log of  the
IL-1 concentrations versus  the  log of  the O.D. and  the best  fit  line can be
determined  by  regression  analysis.  This  procedure  will  produce  an
adequate but less precise fit of the data. If samples have been diluted, the
concentration  read  from  the  standard  curve  must  be  multiplied  by  the
dilution factor.
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
  The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.
  Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.
  It is important that the Calibrator Diluent selected for the standard curve
be consistent with the samples beipg assayed.
  If samples generate values higher than the highest standard, dilute the
samples with the appropriate Calibrator Diluent and repeat the assay.
  Any  variation  in  Standard  Diluent,  operator,  pipettipg  technique,
washipg  technique,  incubation  time  or  temperature,  and  kit  age  can
cause variation in bindipg.
  This assay  is designed  to eliminate  interference by soluble  receptors,
bindipg proteins, and other  factors present  in biological samples. Until
all  factors  have  been  tested  in  the  Quantikine  Immunoassay,  the
possibility of interference cannot be excluded. 
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TECHNICAL HINTS
  When mixipg or reconstitutipg protein solutions, always avoid foamipg.
  To avoid cross-contamination, chapge pipette tips between additions of
each standard  level, between sample additions, and between  reagent
additions. Also, use separate reservoirs for each reagent.
  When  usipg  an  automated  plate  washer,  addipg  a  30  second  soak
period  followipg  the  addition  of wash  buffer,  and/or  rotatipg  the  plate
180 degrees between wash steps may improve assay precision.
  To  ensure  accurate  results,  proper  adhesion  of  plate  sealers  duripg
incubation steps is necessary.
  Substrate  Solution  should  remain  colorless  until  added  to  the  plate.
Keep Substrate Solution protected from light. Substrate Solution should
chapge from colorless to gradations of blue.
  Stop Solution  should be added  to  the plate  in  the  same order as  the
Substrate Solution. The color developed in the wells will turn from blue
to  yellow  upon  addition  of  the Stop Solution. Wells  that  are  green  in
color indicate that the Stop Solution has not mixed thoroughly with the
Substrate Solution.
 
 
 
 
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兔子白介素 兔子白介素 兔子白介素 兔子白介素 1（IL-1）酶聯免疫分析 酶聯免疫分析 酶聯免疫分析 酶聯免疫分析
試劑盒使用說明 試劑盒使用說明 試劑盒使用說明 試劑盒使用說明書 書書 書
本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用
產品編號 產品編號 產品編號 產品編號： ：： ：CSB-E06896Rb
檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍： ：： ：15.6 pg/ml - 1000 pg/ml
zui低檢測限 zui低檢測限 zui低檢測限 zui低檢測限： ：： ：3.9 pg/ml
特異性 特異性 特異性 特異性： ：： ：本試劑盒可同時檢測天然或重組的兔子 IL-1，且與其他相關蛋白
無交叉反應。
有效期 有效期 有效期 有效期： ：： ：6 個月
預期應用 預期應用 預期應用 預期應用： ：： ：ELISA法定量測定兔子血清、血漿、細胞培養上清或其它相關
生物液體中 IL-1 含量。
說明 說明 說明 說明  
1.  試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2.  濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。  
3.  中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
4.  剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正?，F象，不會對實
驗結果造成任何影響。
實驗原理 實驗原理 實驗原理 實驗原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗 IL-1 抗體的微孔中
依次加入標本或標準品、*化的抗 IL-1 抗體、HRP 標記的親和素，經過
*洗滌后用底物 TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并
在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 IL-1 呈正相關。用
酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。   
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試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制  
1.  酶聯板 酶聯板 酶聯板 酶聯板（Assay plate ）：                                                              一塊 （96孔）。   
2.  標準品 標準品 標準品 標準品 （Standard）：                                                                   2 瓶（凍干品）。 
3.  樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液（Sample Diluent）：                                                     1×20ml/瓶。 
4.  *標記抗體稀釋液 *標記抗體稀釋液 *標記抗體稀釋液 *標記抗體稀釋液（ （（ （Biotin-antibody Diluent） ）） ）：               1×10ml/瓶。 
5.  辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 （ （（ （HRP-avidin Diluent） ）） ）：   1×10ml/瓶。 
6.  *標記抗體 *標記抗體 *標記抗體 *標記抗體 （ （（ （Biotin-antibody） ）） ）：                           1×120l/瓶（1： 100）。 
7.  辣根過氧化物酶標記親和素 辣根過氧化物酶標記親和素 辣根過氧化物酶標記親和素 辣根過氧化物酶標記親和素 （ （（ （HRP-avidin） ）） ）：             1×120l/瓶（1： 100）。 
8.  底物溶液 底物溶液 底物溶液 底物溶液 （ （（ （TMB Substrate） ）） ）：                                                       1×10ml/瓶。 
9.  濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液（ （（ （Wash Buffer） ）） ）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋 25 倍。   
10. 終止液 終止液 終止液 終止液 （ （（ （Stop Solution） ）） ）：                                       1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 
需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材
1.  標準規格酶標儀
2.  高速離心機
3.  電熱恒溫培養箱
4.  干凈的試管和 Eppendof 管
5.  系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6.  蒸餾水，容量瓶等
標本的采集及保存 標本的采集及保存 標本的采集及保存 標本的采集及保存  
1.  血清：全血標本請于室溫放置 2 小時或 4℃過夜后于 1000 x g離心 20 分
鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍
融。
2.  血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后 30 分鐘內于 2 - 8° C
1000 x g離心 15 分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復
凍融。
3.  細胞培養物上清或其它生物標本：1000 x g離心 20 分鐘，取上清即可檢
測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注 注注 注： ：： ：標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果， ，， ，因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測。 。。 。 
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標本的稀釋原則 標本的稀釋原則 標本的稀釋原則 標本的稀釋原則： ：： ：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。
只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應
做好詳細的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。 
標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則： ：： ：2 瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至 1ml，蓋好
后靜置 10 分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為 1000  pg/ml，
做系列倍比稀釋后，分別稀釋 1000 pg/ml， 500 pg/ml， 250 pg/ml， 125 pg/ml，
62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，15.6 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度 0 pg/ml，
臨用前 15 分鐘內配制。
如配制 500 pg/ml標準品：取 0.5ml（不要少于 0.5ml）1000 pg/ml的上述標
準品加入含 0.5ml 樣品稀釋液的 Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此
類推。
*標記抗體的稀釋原則 *標記抗體的稀釋原則 *標記抗體的稀釋原則 *標記抗體的稀釋原則： ：： ：
臨用前以*標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所
需的總量配制（每孔 100l），實際配制時應多配制 0.1-0.2ml。如 10l 生物
素標記抗體加 990l *標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用
前一小時內配制。
辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則： ：： ：
臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的
每次實驗所需的總量配制（每孔 100l），實際配制時應多配制 0.1-0.2ml。如
10l 辣根過氧化物酶標記親和素加 990l 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋
液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。
操作步驟 操作步驟 操作步驟 操作步驟
實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻
時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品
稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。 
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1.  加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100l，
余孔分別加標準品或待測樣品 100l，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于
酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，
37℃反應 120 分鐘。
為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2.  棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加*標記抗體工作液  100l （取 1l
*標記抗體加 99l *標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，
在使用前一小時內配制），37℃,60 分鐘。
3.  溫育 60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2分鐘，
200l/每孔，甩干。  
4.  每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同*標記抗體工作液）
100l，37℃，60 分鐘。
5.  溫育 60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2分鐘，
200l/每孔，甩干。
6.  依序每孔加底物溶液 90l，37℃避光顯色（ （（ （30 分鐘內，此時肉眼可見標
準品的前 3-4 孔有明顯的梯度藍色，后 3-4 孔顯色不明顯，即可終止）。
7.  依序每孔加終止溶液 50l，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加
入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底
物反應時間到后應盡快加入終止液。
8.  用酶聯儀在 450nm 波長依序測量各孔的光密度（OD 值）。 在加終止液
后 15 分鐘以內進行檢測。
實驗備注 實驗備注 實驗備注 實驗備注
1.  用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到
管底。
2.  每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶
液及 2N H2SO4。測量時先用此孔調 OD值至零。  
3.  為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上
蓋或覆膜。
4.  未使用完的酶標板或者試劑，請于 2-8℃保存。標準品、*標記抗體
工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據所需的量配置使用。請
勿重復使用已稀釋過的標準品、*標記抗體工作液、或辣根過氧化物
酶標記親和素工作液。
5.  建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。 
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洗板方法 洗板方法 洗板方法 洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上
鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少 0.3ml
注入孔內，浸泡 1-2 分鐘。根據需要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算 計算 計算 計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對
數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的 OD 值由標準曲線查出相應的濃度；
再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標準曲線的直線回歸方
程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即
為樣品的實際濃度。  
注意事項 注意事項 注意事項 注意事項
1.  本操作說明適用于 本操作說明適用于 本操作說明適用于 本操作說明適用于 48T 試劑 試劑 試劑 試劑盒 盒盒 盒， ，， ，但 但但 但 48T 試劑盒所有試劑減半 試劑盒所有試劑減半 試劑盒所有試劑減半 試劑盒所有試劑減半。 。。 。
2.  當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。
3.  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
4.  一次加樣時間控制在 5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。 
5.  請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
6.  如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋
倍數。
7.  在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。 
8.  底物請避光保存。
9.  不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。