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  Rabbit Endothelin 1,ET-1    
ELISA Kit
 
 
 
Catalog No. CSB-E06951Rb
（96T） 
 
  
 
  This  immunoassay kit allows  for  the  in vitro quantitative determination of  rabbit
ET-1 concentrations in serum, plasma and other biological fluids.
  Expiration date      six months from the date of manufacture
  FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.
 
 
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PRINCIPLE OF THE ASSAY
The  microtiter  plate  provided  in  this  kit  has  been  pre-coated  with  an
antibody  specific  to  ET-1.  Standards  or  samples  are  then  added  to  the
appropriate  microtiter  plate  wells  with  a  biotin-conjugated  polyclonal
antibody preparation specific for ET-1 and Avidin conjugated to Horseradish
Peroxidase （HRP） is added to each microplate well and incubated. Then a
TMB  （3,3',5,5'  tetramethyl-benzidine）  substrate  solution  is  added  to  each
well. Only  those  wells  that  contain  ET-1,  biotin-conjugated  antibody  and
enzyme-conjugated  Avidin  will  exhibit  a  change  in  color.  The
enzyme-substrate reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid
solution  and  the  color  change  is  measured  spectrophotometrically  at  a
wavelength of 450 nm ± 2 nm. The concentration of ET-1 in the samples is
then  determined  by  comparing  the O.D.  of  the  samples  to  the  standard
curve.
DETECTION RANGE
3.12  pg/ml-200  pg/ml.  The  standard  curve  concentrations  used  for  the
ELISA’s were 200 pg/ml, 100 pg/ml, 50 pg/ml, 25 pg/ml, 12.5 pg/ml, 6.25
pg/ml, 3.12 pg/ml.
SPECIFICITY
This assay recognizes recombinant and natural rabbit ET-1. No significant
cross-reactivity or interference was observed.
SENSITIVITY
The minimum  detectable  dose  of  rabbit  ET-1  is  typically  less  than  0.78
pg/ml.
The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection （LLD） was defined
as the lowest protein concentration that could be differentiated from zero. 
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MATERIALS PROVIDED
Reagent      Quantity
Assay plate  1
Standard  2
Sample Diluent      1 x 20 ml
Biotin-antibody Diluent      1 x 10 ml
HRP-avidin Diluent        1 x 10 ml
Biotin-antibody      1 x 120µl
HRP-avidin  1 x 120µl
Wash Buffer      
1 x 20 ml
  （25×concentrate）
TMB Substrate      1 x 10 ml
Stop Solution      1 x 10 ml
STORAGE
1.  Unopened  test  kits  should  be  stored  at  2-8°C  upon  receipt  and  the
microtiter plate should be kept in a sealed bag. The test kit may be used
throughout  the  expiration  date  of  the  kit,  provided  it  is  stored  as
prescribed above. Refer to the package label for the expiration date.
2.  Opened  test plate should be stored at 2-8°C  in  the aluminum  foil bag
with desiccants  to minimize exposure  to damp air. The kits will  remain
stable until the expiring date shown, provided it is stored as prescribed
above.    
3.  A  microtiter  plate  reader  with  a  bandwidth  of  10  nm  or  less  and  an
optical  density  range  of  0-3  OD  or  greater  at  450nm  wavelength  is
acceptable for use in absorbance measurement. 
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REAGENT PREPARATION
Bring all reagents to room temperature before use.  
1.  Wash Buffer    If crystals have  formed  in  the concentrate, warm up  to
room  temperature  and  mix  gently  until  the  crystals  have  compley
dissolved. Dilute 20 ml of Wash Buffer Concentrate  into deionized or
distilled water to prepare 500 ml of Wash Buffer.
2.  Standard    Centrifuge  the  standard  vial  at  6000-10000rpm  for  30s.
Reconstitute  the  Standard  with  1.0  ml  of  Sample  Diluent.  This
reconstitution  produces  a  stock  solution  of  200  pg/ml.  Allow  the
standard to sit for a minimum of 15 minutes with gentle agitation prior to
making  serial  dilutions.  The  undiluted  standard  serves  as  the  high
standard （200 pg/ml）. The Sample Diluent serves as the zero standard
（0 pg/ml）. Prepare fresh for each assay. Use within 4 hours and discard
after use.
3.  Biotin-antibody    Centrifuge  the  vial  before  opening.  Dilute  to  the
working  concentration  using  Biotin-antibody  Diluent（1:100）,
respectively.
4.  HRP-avidin    Centrifuge  the vial before opening. Dilute  to  the working
concentration using HRP-avidin Diluent（1:100）, respectively.
Precaution: The Stop Solution provided with  this kit  is an acid solution. Wear
eye, hand, face, and clothing protection when using this material. 
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OTHER SUPPLIES REQUIRED
  Microplate  reader  capable  of measuring  absorbance  at  450  nm, with
the correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.
  Pipettes and pipette tips.
  Deionized or distilled water.
  Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer.
  An incubator which can provide stable incubation conditions up to 37°C
±0.5°C.
SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
  Serum    Use a serum separator  tube （SST） and allow samples  to clot
for 30 minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 g. Remove
serum and assay  immediay or aliquot and  store  samples at  -20°C.
Centrifuge  the  sample  again  after  thawing  before  the  assay.  Avoid
repeated freeze-thaw cycles.
  Plasma    Collect  plasma  using  citrate,  EDTA,  or  heparin  as  an
anticoagulant. Centrifuge for 15 minutes at 1000 g within 30 minutes of
collection. Assay  immediay  or  aliquot  and  store  samples  at  -20°C.
Centrifuge  the  sample  again  after  thawing  before  the  assay.  Avoid
repeated freeze-thaw cycles.
Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay. 
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ASSAY PROCEDURE
Bring  all  reagents  and  samples  to  room  temperature  before  use.  It  is
recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.
All  the  reagents  should  be  added  directly  to  the  liquid  level  in  the well.  The
pipette should avoid contacting the inner wall of the well.
1.  Add  100µl  of  Standard,  Blank,  or  Sample  per  well.  Cover  with  the
adhesive strip. Incubate for 2 hours at 37°C.  
2.  Remove the liquid of each well, don’t wash.  
3.  Add 100µl of Biotin-antibody working solution  to each well.  Incubate
for  1  hour  at  37°C.  Biotin-antibody  working  solution  may  appear
cloudy. Warm  up  to  room  temperature  and  mix  gently  until  solution
appears uniform.
4.  Aspirate each well and wash,  repeating  the process  three  times  for a
total of three washes. Wash: Fill each well with Wash Buffer （200µl） and
let  it  stand  for  2 minutes,  then  remove  the  liquid  by  flicking  the  plate
over a sink. The remaining drops are removed by patting the plate on a
paper  towel.  Complete  removal  of  liquid  at  each  step  is  essential  to
good performance.
5.  Add  100µl  of  HRP-avidin  working  solution  to  each  well.  Cover  the
microtiter plate with a new adhesive strip. Incubate for 1 hour at 37°C.
6.  Repeat the aspiration and wash three times as step 4. 
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7.  Add 90µl of TMB Substrate to each well. Incubate for 10-30 minutes at
37°C.  Keeping  the  plate  away  from  drafts  and  other  temperature
fluctuations in the dark.  
8.  Add  50µl  of  Stop  Solution  to  each  well  when  the  first  four  wells
containing the highest concentration of standards develop obvious blue
color.  If color change does not appear uniform, gently  tap  the plate  to
ensure thorough mixing.
9.  Determine  the optical density of each well within 30 minutes, using a
microplate reader set to 450 nm.
CALCULATION OF RESULTS
Using  the  professional  soft  "Curve  Exert  1.3"  to  make  a  standard  curve  is
recommended, which can be downloaded from our web.
Average the duplicate readings for each standard, control, and sample and
subtract the average zero standard optical density. Create a standard curve
by reducing the data using computer software capable of generating a four
parameter  logistic  （4-PL） curve-fit. As an alternative, construct a standard
curve  by  plotting  the mean  absorbance  for  each  standard  on  the  x-axis
against the concentration on the y-axis and draw a best fit curve through the
points on  the graph. The data may be  linearized by plotting  the  log of  the
ET-1 concentrations versus the log of the O.D. and the best fit line can be
determined  by  regression  analysis.  This  procedure  will  produce  an 
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adequate but less precise fit of the data. If samples have been diluted, the
concentration  read  from  the  standard  curve  must  be  multiplied  by  the
dilution factor.
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
  The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.
  Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.
  It is important that the Standard Diluent selected for the standard curve
be consistent with the samples being assayed.
  If samples generate values higher than the highest standard, dilute the
samples with the appropriate Standard Diluent and repeat the assay.
  Any  variation  in  Standard  Diluent,  operator,  pipetting  technique,
washing  technique,  incubation  time  or  temperature,  and  kit  age  can
cause variation in binding.
  This assay  is designed  to eliminate  interference by soluble  receptors,
binding proteins, and other  factors present  in biological samples. Until
all  factors  have  been  tested  in  the  Immunoassay,  the  possibility  of
interference cannot be excluded.
TECHNICAL HINTS
  Centrifuge vials before opening to collect contents.
  When mixing or reconstituting protein solutions, always avoid foaming. 
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  To avoid cross-contamination, change pipette tips between additions of
each standard  level, between sample additions, and between  reagent
additions. Also, use separate reservoirs for each reagent.
  When  using  an  automated  plate  washer,  adding  a  30  second  soak
period  following  the  addition  of wash  buffer,  and/or  rotating  the  plate
180 degrees between wash steps may improve assay precision.
  To  ensure  accurate  results,  proper  adhesion  of  plate  sealers  during
incubation steps is necessary.
  Substrate Solution should  remain colorless or  light blue until added  to
the  plate.  Keep  Substrate  Solution  protected  from  light.  Substrate
Solution  should  change  from  colorless  or  light  blue  to  gradations  of
blue.
  Stop Solution  should be added  to  the plate  in  the  same order as  the
Substrate Solution. The color developed in the wells will turn from blue
to  yellow  upon  addition  of  the Stop Solution. Wells  that  are  green  in
color indicate that the Stop Solution has not mixed thoroughly with the
Substrate Solution.
 
 
 
 
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兔子內皮素 兔子內皮素 兔子內皮素 兔子內皮素 1（ET-1）酶聯免疫分析 酶聯免疫分析 酶聯免疫分析 酶聯免疫分析
試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用
產品編號 產品編號 產品編號 產品編號： ：： ：CSB-E06951Rb
檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍： ：： ：3.12 pg/ml – 200 pg/ml
zui zuizui zui低檢測限 低檢測限 低檢測限 低檢測限： ：： ：0.78 pg/ml
特異性 特異性 特異性 特異性： ：： ：本試劑盒可同時檢測天然或重組的兔子 ET-1，且與其他相關蛋白
無交叉反應。
有效期 有效期 有效期 有效期： ：： ：6 個月
預期應用 預期應用 預期應用 預期應用： ：： ：ELISA法定量測定兔子血清、血漿、細胞培養上清或其它相關
生物液體中 ET-1 含量。
說明 說明 說明 說明  
1  試劑盒保存：未開封的試劑盒應儲存于 2-8℃；開封后的酶標板應與干燥
劑一起儲存于鋁箔袋中置于 2-8℃保存。僅在此出儲存條件下，產品在有
效期內可正常使用。
2  濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。  
3  中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
4  剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實
驗結果造成任何影響。
實驗原理 實驗原理 實驗原理 實驗原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗 ET-1 抗體的微孔中
依次加入標本或標準品、*化的抗 ET-1 抗體、HRP 標記的親和素，經
過*洗滌后用底物 TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，
并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 ET-1 呈正相關。
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用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。  
試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制  
1.  酶聯板 酶聯板 酶聯板 酶聯板（Assay plate ）：                                                              一塊 （96孔）。   
2.  標準品 標準品 標準品 標準品 （Standard）：                                                                   2 瓶（凍干品）。 
3.  樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液（Sample Diluent）：                                                     1×20ml/瓶。 
4.  *標記抗體稀釋液 *標記抗體稀釋液 *標記抗體稀釋液 *標記抗體稀釋液（ （（ （Biotin-antibody Diluent） ）） ）：               1×10ml/瓶。 
5.  辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 （ （（ （HRP-avidin Diluent） ）） ）     1×10ml/瓶。 
6.  *標記抗體 *標記抗體 *標記抗體 *標記抗體 （ （（ （Biotin-antibody） ）） ）：                           1×120µl/瓶（1： 100）。 
7.  辣根過氧化物酶標記親和素 辣根過氧化物酶標記親和素 辣根過氧化物酶標記親和素 辣根過氧化物酶標記親和素 （ （（ （HRP-avidin） ）） ）：             1×120µl/瓶（1： 100）。 
8.  底物溶液 底物溶液 底物溶液 底物溶液 （ （（ （TMB Substrate） ）） ）：                                                       1×10ml/瓶。   
9.  濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液（ （（ （Wash Buffer） ）） ）  1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋 25 倍。   
10. 終止液 終止液 終止液 終止液（ （（ （Stop Solution） ）） ）：                                                            1×10ml/瓶。 
需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材
1.  標準規格酶標儀
2.  高速離心機
3.  電熱恒溫培養箱
4.  干凈的試管和 Eppendof 管
5.  系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6.  蒸餾水，容量瓶等
標本的采集及保存 標本的采集及保存 標本的采集及保存 標本的采集及保存  
1.  血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，
取上清即可立即檢測；或進行分裝，并將標本放于-20℃或-80℃保存，但
應避免反復凍融。解凍后的樣品應再次離心，然后檢測。
2.  血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后 30 分鐘內于 2  -  8°C
1000 g離心 15 分鐘，取上清即可立即檢測；或進行分裝，并將標本放于
-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。解凍后的樣品應再次離心，然后
檢測。
注 注注 注： ：： ：標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果， ，， ，因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測。 。。 。
 
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標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則： ：： ：2 瓶，使用前于 6000-10000rpm 離心 30 秒。 每
瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至 1ml，蓋好后靜置 10 分鐘以上，然后反復顛倒
/搓動以助溶解，其濃度為200 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋200 pg/ml，
100 pg/ml，50 pg/ml，25 pg/ml，12.5 pg/ml，6.25 pg/ml，3.12 pg/ml，樣
品稀釋液直接作為標準濃度 0  pg/ml，臨用前 15 分鐘內配制，用完丟棄，下
次檢測使用新鮮配置的標準品。
如配制 100  pg/ml標準品：取 0.5ml（不要少于 0.5ml）200  pg/ml的上述標
準品加入含 0.5ml 樣品稀釋液的 Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此
類推。
*標記抗體的稀釋原則 *標記抗體的稀釋原則 *標記抗體的稀釋原則 *標記抗體的稀釋原則： ：： ：
打開瓶蓋前請離心，收集瓶壁上的溶液。臨用前以*標記抗體稀釋液稀
釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔 100µl），實際
配制時應多配制 0.1-0.2ml。如 10µl*標記抗體加 990µl*標記抗體
稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。
辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則： ：： ：
打開瓶蓋前請離心，收集瓶壁上的溶液。臨用前以辣根過氧化物酶標記親和
素稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔
100µl），實際配制時應多配制 0.1-0.2ml。如10µl辣根過氧化物酶標記親和素
加 990µl 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用
前一小時內配制。
操作步驟 操作步驟 操作步驟 操作步驟
實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻
時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品
稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。加樣時，槍頭應直接對
準液面，切勿沿孔壁加樣。
1  加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100µl，
余孔分別加標準品或待測樣品 100µl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于
酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，
37℃反應 120 分鐘。
為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。 
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2  棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加*標記抗體工作液  100µl （取 1µl
*標記抗體加 99µl *標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，
在使用前一小時內配制），37 ,60 ℃ 分鐘。
3  溫育 60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2分鐘，
200µl/每孔，甩干。  
4  每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同*標記抗體工作液）
100µl，37℃，60 分鐘。
5  溫育 60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2分鐘，
200µl/每孔，甩干。
6  依序每孔加底物溶液 90µl，37℃避光顯色（ （（ （20-30 分鐘內，此時肉眼可
見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）。 
7  依序每孔加終止溶液 50µl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加
入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底
物反應時間到后應盡快加入終止液。
8  用酶聯儀在 450nm 波長依序測量各孔的光密度（OD 值）。 在加終止液
后 15 分鐘以內進行檢測。
實驗備注 實驗備注 實驗備注 實驗備注
1.  用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到
管底。
2.  每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶
液及終止液。測量時先用此孔調 OD值至零。  
3.  為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上
蓋或覆膜。
4.  未使用完的酶標板或者試劑，請于 2-8℃保存。標準品、*標記抗體
工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據所需的量配置使用。請
勿重復使用已稀釋過的標準品、*標記抗體工作液、或辣根過氧化物
酶標記親和素工作液。
5.  建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
洗板方法 洗板方法 洗板方法 洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上
鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少 0.3ml
注入孔內，浸泡 1-2 分鐘。根據需要，重復此過程數次。 
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自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算 計算 計算 計算
請從我們的下載專業軟件"Curve Exert 1.3"，并根據提示制作標準曲線。
以標準物的濃度為縱坐標（對數坐標），OD值為橫坐標（普通坐標），在半對
數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的 OD 值由標準曲線查出相應的濃度；
再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標準曲線的直線回歸方
程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即
為樣品的實際濃度。
注意事項 注意事項 注意事項 注意事項
1.  本操作說明 本操作說明 本操作說明 本操作說明也 也也 也適用于 適用于 適用于 適用于 48T 試劑盒 試劑盒 試劑盒 試劑盒， ，， ，  48T 試劑盒中酶聯板 試劑盒中酶聯板 試劑盒中酶聯板 試劑盒中酶聯板、 、、 、標準品 標準品 標準品 標準品、 、、 、生物 生物 生物 生物
素標記抗體及辣根過氧化物酶標記親和素減半 素標記抗體及辣根過氧化物酶標記親和素減半 素標記抗體及辣根過氧化物酶標記親和素減半 素標記抗體及辣根過氧化物酶標記親和素減半。 。。 。
2.  當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。
3.  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
4.  一次加樣時間控制在 5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。 
5.  請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
6.  如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋
倍數。
7.  在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。 
8.  底物請避光保存。
9.  不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。