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Human Leptin （LEP）
ELISA Kit
 
 
Catalog No. CSB-E04649h
（96 tests）
 
 
 
 
  This immunoassay kit allows for the in vitro quantitative determination of human
LEP  concentrations  in  cell  culture  supernates,  serum,  plasma  and  other
biological fluids.
  Expiration date      six months from the date of manufacture
  FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.
 
 
 
 
 
CUSABIO BIOTECH CO., Ltd.
/    /
: cusabio@    cusabio@ 
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INTRODUCTION
Leptin  is  a  16  kDa  protein  hormone  that  plays  a  key  role  in  regulating
energy  intake and energy expenditure,  including appetite and metabolism.
Leptin is one of the most important adipose derived hormones. The Ob（Lep）
gene （Ob for obese, Lep for leptin） is located on chromosome 7 in humans.
Leptin interacts with six types of receptors （Ob-Ra–Ob-Rf, or LepRa-LepRf）
which  in  turn  are  encoded  by  a  single  gene,  LEPR.  Ob-Rb  is  the  only
receptor  isoform  that can signal  intracellularly via  the Jak-Stat and MAPK
signal transduction pathways, and is present in hypothalamic nuclei.
In addition to being a biomarker for body fat, serum leptin levels also reflect
individual  energy  balance.  Several  studies  have  shown  that  fasting  or
following a very low calorie diet （VLCD） lowers leptin levels. It might be that
on short term leptin is an indicator of energy balance. This system is more
sensitive  to  starvation  than  to  overfeeding,  i.e.  leptin  levels  do  not  rise
extensively after overfeeding. It might be that the dynamics of leptin due to
an acute change in energy balance are related to appetite and eventually to
food intake. Although this is a new hypothesis, there are already some data
that support it.
Leptin binds  to  the  ventromedial nucleus of  the hypothalamus,  known as
the  "appetite  center."  Leptin  signals  to  the  brain  that  the  body  has  had
enough  to  eat,  or  satiety.  A  very  small  group  of  humans  possess
homozygous （same on both of the pair） mutations for the leptin gene which
leads  to  a  constant  desire  for  food,  resulting  in  severe  obesity.  This
condition can be treated successfully by the administration of recombinant
human  leptin. Thus, circulating  leptin  levels give  the brain  input  regarding
energy storage so it can regulate appetite and metabolism. Leptin works by
inhibiting  the  activity  of  neurons  that  contain  neuropeptide  Y  （NPY）  and 
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agouti-related  peptide  （AgRP）,  and  by  increasing  the  activity  of  neurons
expressing  α-melanocyte-stimulating  hormone  （α-MSH）.  Leptin  is  also
strongly  linked with  angiogenesis,  increasing Vascular  endothelial  growth
factor （VEGF） levels.
Although  leptin  is  a  circulating  signal  that  reduces  appetite,  in  general,
obese  people  have  an  unusually  high  circulating  concentration  of  leptin.
These people are said  to be  resistant  to  the effects of  leptin,  in much  the
same way  that people with  type 2 diabetes are  resistant  to  the effects of
insulin.  The  high  sustained  concentrations  of  leptin  from  the  enlarged
adipose stores result in leptin desensitization. The pathway of leptin control
in  obese  people  might  be  flawed  at  some  point  so  the  body  doesn't
adequay receive the satiety feeling subsequently to eating.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The  microtiter  plate  provided  in  this  kit  has  been  pre-coated  with  an
antibody  specific  to  LEP.  Standards  or  samples  are  then  added  to  the
appropriate  microtiter  plate  wells  with  a  biotin-conjugated  polyclonal
antibody preparation specific for LEP and Avidin conjugated to Horseradish
Peroxidase （HRP） is added to each microplate well and incubated. Then a
TMB  （3,3'5,  5'  tetramethyl-benzidine）  substrate  solution  is added  to  each
well.  Only  those  wells  that  contain  LEP,  biotin-conjugated  antibody  and
enzyme-conjugated  Avidin  will  exhibit  a  change  in  color.  The
enzyme-substrate reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid
solution  and  the  color  change  is  measured  spectrophotometrically  at  a
wavelength of 450 nm ± 2 nm. The concentration of LEP in the samples is
then  determined  by  comparing  the O.D.  of  the  samples  to  the  standard
curve. 
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DETECTION RANGE
0.32  ng/ml-20  ng/ml.  The  standard  curve  concentrations  used  for  the
ELISA’s were 20 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml,2.5 ng/ml, 1.25 ng/ml, 0.62 ng/ml,
0.32 ng/ml.
SPECIFICITY
This assay recognizes recombinant and natural human LEP. No significant
cross-reactivity or interference was observed.
SENSITIVITY
The minimum  detectable  dose  of  human  LEP  is  typically  less  than  0.08
ng/ml.
The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection （LLD） was defined
as the lowest protein concentration that could be differentiated from zero.
MATERIALS PROVIDED
Reagent      Quantity
Assay plate  1
Standard  2
Sample Diluent      1 x 20 ml
Biotin-antibody Diluent      1 x 10 ml
HRP-avidin Diluent        1 x 10 ml
Biotin-antibody      1 x 120l
HRP-avidin  1 x 120l
Wash Buffer      
1 x 20 ml
  （25×concentrate）
TMB Substrate      1 x 10 ml
Stop Solution      1 x 10 ml 
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STORAGE
1.  Unopened  test  kits  should  be  stored  at  2-8°C  upon  receipt  and  the
microtiter  plate  should  be  kept  in  a  sealed  bag  with  desiccants  to
minimize exposure to damp air. The test kit may be used throughout the
expiration date of  the kit. Refer  to  the package  label  for  the expiration
date.
2.  Opened  test  kits  will  remain  stable  until  the  expiring  date  shown,
provided it is stored as prescribed above.    
3.  A  microtiter  plate  reader  with  a  bandwidth  of  10  nm  or  less  and  an
optical  density  range  of  0-3  OD  or  greater  at  450nm  wavelength  is
acceptable for use in absorbance measurement.
REAGENT PREPARATION
Bring all reagents to room temperature before use.  
1.  Wash  Buffer    If  crystals  have  formed  in  the  concentrate,  warm  to
room  temperature  and  mix  gently  until  the  crystals  have  compley
dissolved. Dilute 20 ml of Wash Buffer Concentrate  into deionized or
distilled water to prepare 500 ml of Wash Buffer.
2.  Standard    Reconstitute the Standard with 1.0 ml of Sample Diluent.
This  reconstitution  produces  a  stock  solution  of  20  ng/ml.  Allow  the
standard to sit for a minimum of 15 minutes with gentle agitation prior to
making  serial  dilutions.  The  undiluted  standard  serves  as  the  high
standard （20 ng/ml）. The Sample Diluent serves as the zero standard
（0 ng/ml）.
3.  Biotin-antibody    Dilute  to  the  working  concentration  using
Biotin-antibody Diluent（1:100）, respectively. 
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4.  HRP-avidin    Dilute  to  the  working  concentration  using  HRP-avidin
Diluent（1:100）, respectively.
Precaution: The Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear
eye, hand, face, and clothing protection when using this material.
OTHER SUPPLIES REQUIRED
  Microplate  reader  capable  of measuring  absorbance  at  450  nm, with
the correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.
  Pipettes and pipette tips.
  Deionized or distilled water.
  Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer.
SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
  Cell Culture Supernates    Remove particulates by centrifugation and
assay immediay or aliquot and store samples at -20° C. Avoid
repeated freeze-thaw cycles.
  Serum    Use a serum separator  tube （SST） and allow samples  to clot
for 30 minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 x g. Remove
serum and assay  immediay or aliquot and store samples at  -20° C.
Avoid repeated freeze-thaw cycles.
  Plasma    Collect plasma using citrate, EDTA, or heparin as an
anticoagulant. Centrifuge for 15 minutes at 1000 x g within 30 minutes
of collection. Assay immediay or aliquot and store samples at -20° C.
Avoid repeated freeze-thaw cycles.
Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay. 
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ASSAY PROCEDURE
Bring all reagents and samples to room temperature before use. It is
recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.
1.  Add  100l  of  Standard,  Blank,  or  Sample  per  well.  Cover  with  the
adhesive strip. Incubate for 2 hours at 37° C.  
2.  Remove the liquid of each well, don’t wash.  
3.  Add 100l of Biotin-antibody working solution  to each well.  Incubate
for  1  hour  at  37°C.  Biotin-antibody  working  solution  may  appear
cloudy.  Warm  to  room  temperature  and  mix  gently  until  solution
appears uniform.
4.  Aspirate each well and wash,  repeating  the process  three  times  for a
total of three washes. Wash by filling each well with Wash Buffer （200l）
using  a  squirt  bottle,  multi-channel  pipette,  manifold  dispenser  or
autowasher.  Complete  removal  of  liquid  at  each  step  is  essential  to
good  performance. After  the  last wash,  remove  any  remaining Wash
Buffer  by  aspirating  or  decanting.  Invert  the  plate  and  blot  it  against
clean paper towels.
5.  Add  100l  of  HRP-avidin  working  solution  to  each  well.  Cover  the
microtiter plate with a new adhesive strip. Incubate for 1 hour at 37° C.
6.  Repeat the aspiration and wash three times as step 4.
7.  Add 90l of TMB Substrate to each well. Incubate for 10-30 minutes at
37°C.  Keeping  the  plate  away  from  drafts  and  other  temperature
fluctuations in the dark.  
8.  Add  50l  of  Stop  Solution  to  each  well  when  the  first  four  wells
containing the highest concentration of standards develop obvious blue
color.  If color change does not appear uniform, gently  tap  the plate  to
ensure thorough mixing.
9.  Determine  the optical density of each well within 30 minutes, using a
microplate reader set to 450 nm. 
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CALCULATION OF RESULTS
Average the duplicate readings for each standard, control, and sample and
subtract the average zero standard optical density. Create a standard curve
by reducing the data using computer software capable of generating a four
parameter  logistic  （4-PL） curve-fit. As an alternative, construct a standard
curve  by  plotting  the mean  absorbance  for  each  standard  on  the  y-axis
against the concentration on the x-axis and draw a best fit curve through the
points on  the graph. The data may be  linearized by plotting  the  log of  the
LEP concentrations versus  the  log of  the O.D. and  the best  fit  line can be
determined  by  regression  analysis.  This  procedure  will  produce  an
adequate but less precise fit of the data. If samples have been diluted, the
concentration  read  from  the  standard  curve  must  be  multiplied  by  the
dilution factor.
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
  The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.
  Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.
  It is important that the Calibrator Diluent selected for the standard curve
be consistent with the samples being assayed.
  If samples generate values higher than the highest standard, dilute the
samples with the appropriate Calibrator Diluent and repeat the assay.
  Any  variation  in  Standard  Diluent,  operator,  pipetting  technique,
washing  technique,  incubation  time  or  temperature,  and  kit  age  can
cause variation in binding.
  This assay  is designed  to eliminate  interference by soluble  receptors,
binding proteins, and other  factors present  in biological samples. Until
all  factors  have  been  tested  in  the  Quantikine  Immunoassay,  the
possibility of interference cannot be excluded. 
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TECHNICAL HINTS
  Centrifuge vials before opening to collect contents.
  When mixing or reconstituting protein solutions, always avoid foaming.
  To avoid cross-contamination, change pipette tips between additions of
each standard  level, between sample additions, and between  reagent
additions. Also, use separate reservoirs for each reagent.
  When  using  an  automated  plate  washer,  adding  a  30  second  soak
period  following  the  addition  of wash  buffer,  and/or  rotating  the  plate
180 degrees between wash steps may improve assay precision.
  To  ensure  accurate  results,  proper  adhesion  of  plate  sealers  during
incubation steps is necessary.
  Substrate  Solution  should  remain  colorless  until  added  to  the  plate.
Keep Substrate Solution protected from light. Substrate Solution should
change from colorless to gradations of blue.
  Stop Solution  should be added  to  the plate  in  the  same order as  the
Substrate Solution. The color developed in the wells will turn from blue
to  yellow  upon  addition  of  the Stop Solution. Wells  that  are  green  in
color indicate that the Stop Solution has not mixed thoroughly with the
Substrate Solution.
 
 
 
 
 
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人瘦素 人瘦素 人瘦素 人瘦素（LEP）酶聯(lián)免疫分析 酶聯(lián)免疫分析 酶聯(lián)免疫分析 酶聯(lián)免疫分析
試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用
產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品編號(hào)： ：： ：CSB-E04649h
檢測(cè)范圍 檢測(cè)范圍 檢測(cè)范圍 檢測(cè)范圍： ：： ：0.32 ng/ml - 20 ng/ml
zui低檢測(cè)限 zui低檢測(cè)限 zui低檢測(cè)限 zui低檢測(cè)限： ：： ：0.08 ng/ml
特異性 特異性 特異性 特異性： ：： ：本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)天然或重組的人 LEP，且與其他相關(guān)蛋白無(wú)
交叉反應(yīng)。
有效期 有效期 有效期 有效期： ：： ：6 個(gè)月
預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用： ：： ：ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生
物液體中 LEP 含量。
說明 說明 說明 說明： ：： ：
1.  試劑盒保存：-20℃（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。
2.  濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。  
3.  中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn)。
4.  剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)
驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)原理： ：： ：
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗 LEP 抗體的微孔中
依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、*化的抗 LEP抗體、HRP 標(biāo)記的親和素，經(jīng)過
*洗滌后用底物 TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并
在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 LEP 呈正相關(guān)。用
酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。   
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試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制： ：： ：
1.  酶聯(lián) 酶聯(lián) 酶聯(lián) 酶聯(lián)板 板板 板（Assay plate ）：                                                              一塊 （96孔）。   
2.  標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 （Standard）：                                                                   2 瓶（凍干品）。 
3.  樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液（Sample Diluent）：                                                     1×20ml/瓶。 
4.  *標(biāo)記抗體稀釋液 *標(biāo)記抗體稀釋液 *標(biāo)記抗體稀釋液 *標(biāo)記抗體稀釋液（ （（ （Biotin-antibody Diluent） ）） ）：               1×10ml/瓶。 
5.  辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （ （（ （HRP-avidin Diluent） ）） ）：   1×10ml/瓶。 
6.  *標(biāo)記抗體 *標(biāo)記抗體 *標(biāo)記抗體 *標(biāo)記抗體 （ （（ （Biotin-antibody） ）） ）：                           1×120l/瓶（1： 100）。 
7.  辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素 （ （（ （HRP-avidin） ）） ）：               1×120l/瓶（1： 100）。 
8.  底物溶液 底物溶液 底物溶液 底物溶液 （ （（ （TMB Substrate） ）） ）：                                                       1×10ml/瓶。   
9.  濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液（ （（ （Wash Buffer） ）） ）  1×20ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋 25 倍。   
10. 終止液 終止液 終止液 終止液 （ （（ （Stop Solution） ）） ）：                                                             1×10ml/瓶 。 
需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材： ：： ：
1.  標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2.  高速離心機(jī)
3.  電熱恒溫培養(yǎng)箱
4.  干凈的試管和 Eppendof 管
5.  系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，用多通道移液器
6.  蒸餾水，容量瓶等
標(biāo)本的采集及保存 標(biāo)本的采集及保存 標(biāo)本的采集及保存 標(biāo)本的采集及保存： ：： ：
1.  血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置 2 小時(shí)或 4℃過夜后于 1000 x g離心 20 分
鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍
融。
2.  血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后 30 分鐘內(nèi)于 2 - 8° C
1000 x g離心 15 分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)
凍融。
3.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心 20 分鐘，取上清即可檢
測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注 注注 注： ：： ：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果 標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果 標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果 標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果， ，， ，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè) 因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè) 因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè) 因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。 。。 。 
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標(biāo)本的稀釋原則 標(biāo)本的稀釋原則 標(biāo)本的稀釋原則 標(biāo)本的稀釋原則： ：： ：
首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。
只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)
做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算濃度時(shí)，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。 
標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則： ：： ：2 瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至 1ml，蓋好
后靜置 10 分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為 20  ng/ml，做
系列倍比稀釋后，分別稀釋 20 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml,2.5 ng/ml, 1.25 ng/ml,
0.62 ng/ml, 0.32 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度 0 ng/ml，臨用前 15
分鐘內(nèi)配制。
如配制 10  ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)品：取 0.5ml（不要少于 0.5ml）20  ng/ml 的上述標(biāo)準(zhǔn)
品加入含 0.5ml 樣品稀釋液的 Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此類
推。
*標(biāo)記抗體的稀釋原則 *標(biāo)記抗體的稀釋原則 *標(biāo)記抗體的稀釋原則 *標(biāo)記抗體的稀釋原則： ：： ：
臨用前以*標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所
需的總量配制（每孔 100l），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制 0.1-0.2ml。如 10l 生物
素標(biāo)記抗體加 990l *標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用
前一小時(shí)內(nèi)配制。
辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則： ：： ：
臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的
每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔 100l），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制 0.1-0.2ml。如
10l 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加 990l 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋
液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。
操作步驟 操作步驟 操作步驟 操作步驟： ：： ：
實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r(shí)，均需混勻，混勻
時(shí)盡量避免起泡。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí)，用樣品
稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍。 
  13
1.  加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100l，
余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品 100l，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于
酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，
37℃反應(yīng) 120 分鐘。
為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2.  棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加*標(biāo)記抗體工作液  100l （取 1l
*標(biāo)記抗體加 99l *標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，
在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37℃,60 分鐘。
3.  溫育 60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2分鐘，
200l/每孔，甩干。  
4.  每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同*標(biāo)記抗體工作液）
100l，37℃，60 分鐘。
5.  溫育 60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2分鐘，
200l/每孔，甩干。
6.  依序每孔加底物溶液 90l，37℃避光顯色（ （（ （30 分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)
準(zhǔn)品的前 3-4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后 3-4 孔梯度不明顯，即可終止）。
7.  依序每孔加終止溶液 50l，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加
入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底
物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8.  用酶聯(lián)儀在 450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD 值）。 在加終止液
后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)備注 實(shí)驗(yàn)備注 實(shí)驗(yàn)備注 實(shí)驗(yàn)備注
1.  用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到
管底。
2.  每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶
液及 2N H2SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào) OD值至零。  
3.  為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上
蓋或覆膜。
4.  未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于 2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、*標(biāo)記抗體
工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)
勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、*標(biāo)記抗體工作液、或辣根過氧化物
酶標(biāo)記親和素工作液。
5.  建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 
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洗板方法 洗板方法 洗板方法 洗板方法： ：： ：
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上
鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少 0.3ml
注入孔內(nèi)，浸泡 1-2 分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
計(jì)算 計(jì)算 計(jì)算 計(jì)算： ：： ：
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)
數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；
再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方
程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即
為樣品的實(shí)際濃度。  
注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng)： ：： ：
1.  當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。
2.  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。
3.  一次加樣時(shí)間控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。 
4.  請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。
5.  如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋
倍數(shù)。
6.  在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。 
7.  底物請(qǐng)避光保存。
8.  不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。 
 
 

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