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Human Interferon γ （IFN-γ）
ELISA Kit
 
 
Catalog No. CSB-E04577h
（96T）
 
 
 
  This immunoassay kit allows for the in vitro quantitative determination of human IFN-γ
concentrations in cell culture supernates, serum, plasma and other biological fluids.
  Expiration date      six months from the date of manufacture
  FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.
 
 
 
 
CUSABIO BIOTECH CO., Ltd.
/    /
: cusabio@    cusabio@
 
  2
INTRODUCTION
Interferon-gamma （IFN-γ） is a dimerized soluble cytokine that is the only member
of  the  type  II  class  of  interferons.  This  interferon  was  originally  called
macrophage-activating  factor.  The  IFN-γ  monomer  consists  of  a  core  of  six
α-helices  and  an  extended  unfolded  sequence  in  the  C-terminal  region.  This  is
shown in the structural models below. The α-helices in the core of the structure are
numbered 1  to 6. Full  length  IFN-γ  is 143 amino acids  in  length,  the models are
126  amino  acids  in  length.  Affinity  for  the  glycosaminoglycan  heparan  sulfate
resides  solely  within  the  deleted  sequence  of  17  amino  acids.  In  contrast  to
interferon-α and interferon-β which can be expressed by all cells, IFN-γ is secreted
by  Th1  cells,  Tc  cells,  dendritic  cells  and  NK  cells.  Also  known  as  immune
interferon,  IFN-γ  is  the  only Type  II  interferon.  It  is  serologically  distinct  from
Type I interferons and it is acid-labile, while the type I variants are acid-stable.
IFN-γ  has  antiviral,  immunoregulatory,  and  anti-tumour  properties.  It  alters
transcription  in up  to 30 genes producing  a variety  of physiological  and  cellular
responses. Amongst the effects are: Increase antigen presentation of macrophages.
Activate  and  increase  lysosome  activity  in  macrophages.  Suppress  Th2  cell
activity.  Cause  normal  cells  to  increase  expression  of  class  I MHC  molecules.
Promotes adhesion and binding required for leukocyte migration Promotes NK cell
activity. Activation  by  IFN-γ  is  achieved  by  its  interaction with  a  heterodimeric
receptor  consisting  of  IFNGR1 &  IFNGR2  （interferon  gamma  receptors）.  IFN-γ
binding  to  the  receptor  activates  the  JAK-STAT  pathway.  In  addition,  IFN-γ
activates APCs and promotes Th1 differentiation by upregulating the transcription
factor  T-bet.  IFN-γ  is  the  hallmark  cytokine  of  Th1  cells  （whereas  Th2  cells
produce IL-4 and Th17 cells produce IL-17）. NK cells and CD8+ cytotoxic T cells
also  produce  IFN-γ.  IFN-γ  suppresses  osteoclast  formation  by  rapidly  degrading
the  RANK  adaptor  protein  TRAF6  in  the  RANK-RANKL  signaling  pathway,
which otherwise stimulates the production of NFκB. 
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PRINCIPLE OF THE ASSAY
The  microtiter  plate  provided  in  this  kit  has  been  pre-coated  with  an  antibody
specific  to  IFN-γ.  Standards  or  samples  are  then  added  to  the  appropriate
microtiter  plate  wells  with  a  biotin-conjugated  polyclonal  antibody  preparation
specific  for  IFN-γ  and  Avidin  conjugated  to  Horseradish  Peroxidase  （HRP）  is
added  to  each  microplate  well  and  incubated.  Then  a  TMB  （3,3'5,  5'
tetramethyl-benzidine）  substrate  solution  is added  to each well. Only  those wells
that contain IFN-γ, biotin-conjugated antibody and enzyme-conjugated Avidin will
exhibit  a  change  in  color.  The  enzyme-substrate  reaction  is  terminated  by  the
addition  of  a  sulphuric  acid  solution  and  the  color  change  is  measured
spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm ±  2 nm. The concentration of
IFN-γ in the samples is then determined by comparing the O.D. of the samples to
the standard curve.
DETECTION RANGE
0.78 ng/ml-50 ng/ml. The standard curve concentrations used for the ELISA’s were
50 ng/ml, 25 ng/ml, 12.5 ng/ml, 6.25 ng/ml, 3.12 ng/ml, 1.56 ng/ml, 0.78 ng/ml.
SPECIFICITY
This  assay  recognizes  recombinant  and  natural  human  IFN-γ.  No  significant
cross-reactivity or interference was observed.
SENSITIVITY
The minimum detectable dose of human IFN-γ is typically less than 0.195 ng/ml.
The  sensitivity of  this assay, or Lower Limit of Detection  （LLD） was defined as
the lowest protein concentration that could be differentiated from zero. 
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MATERIALS PROVIDED
Reagent      Quantity
Assay plate  1
Standard  2
Sample Diluent      1 x 20 ml
Biotin-antibody Diluent      1 x 10 ml
HRP-avidin Diluent        1 x 10 ml
Biotin-antibody      1 x 120l
HRP-avidin  1 x 120l
Wash Buffer      
1 x 20 ml
  （25×concentrate）
TMB Substrate      1 x 10 ml
Stop Solution      1 x 10 ml
STORAGE
1.  Unopened  test kits  should be  stored at 2-8°C upon  receipt and  the microtiter
plate  should be kept  in a  sealed bag with desiccants  to minimize exposure  to
damp  air. The  test kit may be used  throughout  the  expiration date of  the kit.
Refer to the package label for the expiration date.
2.  Opened test kits will remain stable until the expiring date shown, provided it is
stored as prescribed above.    
3.  A microtiter  plate  reader with  a  bandwidth  of  10  nm  or  less  and  an  optical
density range of 0-3 OD or greater at 450nm wavelength is acceptable for use
in absorbance measurement. 
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REAGENT PREPARATION
Bring all reagents to room temperature before use.  
1.  Wash  Buffer    If  crystals  have  formed  in  the  concentrate,  warm  to  room
temperature  and  mix  gently  until  the  crystals  have  compley  dissolved.
Dilute 20 ml of Wash Buffer Concentrate  into deionized or distilled water  to
prepare 500 ml of Wash Buffer.
2.  Standard    Reconstitute  the Standard with 1.0 ml of Sample Diluent. This
reconstitution produces a stock solution of 50 ng/ml. Allow the standard to sit
for  a  minimum  of  15  minutes  with  gentle  agitation  prior  to  making  serial
dilutions. The undiluted standard serves as  the high standard （50 ng/ml）. The
Sample Diluent serves as the zero standard （0 ng/ml）.
3.  Biotin-antibody    Dilute  to  the working  concentration  specified  on  the  vial
label using Biotin-antibody Diluent（1:100）, respectively.
4.  HRP-avidin    Dilute  to  the working concentration specified on  the vial  label
using HRP-avidin Diluent（1:100）, respectively.
Precaution: The Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear
eye, hand, face, and clothing protection when using this material.
OTHER SUPPLIES REQUIRED
  Microplate  reader  capable  of  measuring  absorbance  at  450  nm,  with  the
correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.
  Pipettes and pipette tips.
  Deionized or distilled water.
  Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer. 
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SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
  Cell Culture Supernates    Remove particulates by centrifugation and assay
immediay or aliquot and store samples at -20° C. Avoid repeated
freeze-thaw cycles.
  Serum    Use a  serum  separator  tube  （SST） and allow  samples  to clot  for 30
minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 x g. Remove serum and
assay  immediay  or  aliquot  and  store  samples  at  -20°  C.  Avoid  repeated
freeze-thaw cycles.
  Plasma    Collect plasma using citrate, EDTA, or heparin as an anticoagulant.
Centrifuge for 15 minutes at 1000 x g within 30 minutes of collection. Assay
immediay or aliquot and store samples at -20° C. Avoid repeated
freeze-thaw cycles.
Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.
ASSAY PROCEDURE
Bring all reagents and samples to room temperature before use. It is
recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.
1.  Add 100l of Standard, Blank, or Sample per well. Cover with  the adhesive
strip. Incubate for 2 hours at 37° C.  
2.  Remove the liquid of each well, don’t wash.  
3.  Add 100l of Biotin-antibody working solution  to each well.  Incubate  for 1
hour at 37°C. Biotin-antibody working solution may appear cloudy. Warm to
room temperature and mix gently until solution appears uniform.
4.  Aspirate each well and wash,  repeating  the process  three  times  for a  total of
three washes. Wash  by  filling  each well with Wash Buffer  （200l）  using  a
squirt  bottle,  multi-channel  pipette,  manifold  dispenser  or  autowasher.
Complete  removal  of  liquid  at  each  step  is  essential  to  good  performance.
After  the  last  wash,  remove  any  remaining  Wash  Buffer  by  aspirating  or
decanting. Invert the plate and blot it against clean paper towels. 
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5.  Add 100l of HRP-avidin working solution to each well. Cover the microtiter
plate with a new adhesive strip. Incubate for 1 hour at 37° C.
6.  Repeat the aspiration and wash three times as step 4.
7.  Add 90l of TMB Substrate  to each well.  Incubate  for 30 minutes at 37°C.
Keeping  the plate away  from drafts and other  temperature fluctuations  in  the
dark.
8.  Add  50l  of  Stop  Solution  to  each  well.  If  color  change  does  not  appear
uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.
9.  Determine  the  optical  density  of  each  well  within  30  minutes,  using  a
microplate reader set to 450 nm.
CALCULATION OF RESULTS
Average the duplicate readings for each standard, control, and sample and subtract
the average zero standard optical density. Create a standard curve by reducing the
data using computer software capable of generating a four parameter logistic （4-PL）
curve-fit.  As  an  alternative,  construct  a  standard  curve  by  plotting  the  mean
absorbance for each standard on the y-axis against the concentration on the x-axis
and  draw  a  best  fit  curve  through  the  points  on  the  graph.  The  data  may  be
linearized by plotting the log of the IFN-γ concentrations versus the log of the O.D.
and the best fit line can be determined by regression analysis. This procedure will
produce an adequate but  less precise fit of  the data. If samples have been diluted,
the concentration read from  the standard curve must be multiplied by  the dilution
factor.
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
  The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.
  Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.
  It is important that the Calibrator Diluent selected for the standard curve be
consistent with the samples being assayed. 
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  If samples generate values higher than the highest standard, dilute the samples
with the appropriate Calibrator Diluent and repeat the assay.
  Any  variation  in  Standard  Diluent,  operator,  pipetting  technique,  washing
technique,  incubation  time or  temperature, and kit age can cause variation  in
binding.
  This assay  is designed  to eliminate  interference by soluble receptors, binding
proteins, and other factors present in biological samples. Until all factors have
been  tested  in  the  Quantikine  Immunoassay,  the  possibility  of  interference
cannot be excluded.
TECHNICAL HINTS
  When mixing or reconstituting protein solutions, always avoid foaming.
  To avoid cross-contamination, change pipette  tips between additions of each
standard level, between sample additions, and between reagent additions. Also,
use separate reservoirs for each reagent.
  When  using  an  automated  plate  washer,  adding  a  30  second  soak  period
following  the  addition  of wash  buffer,  and/or  rotating  the  plate  180  degrees
between wash steps may improve assay precision.
  To ensure accurate results, proper adhesion of plate sealers during  incubation
steps is necessary.
  Substrate  Solution  should  remain  colorless  until  added  to  the  plate.  Keep
Substrate  Solution  protected  from  light.  Substrate  Solution  should  change
from colorless to gradations of blue.
  Stop Solution should be added  to  the plate  in  the same order as  the Substrate
Solution. The color developed in the wells will turn from blue to yellow upon
addition of  the Stop Solution. Wells  that  are green  in  color  indicate  that  the
Stop Solution has not mixed thoroughly with the Substrate Solution.
 
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人 人人 人 γ 干擾素 干擾素 干擾素 干擾素（IFN-γ）酶聯(lián)免疫分析 酶聯(lián)免疫分析 酶聯(lián)免疫分析 酶聯(lián)免疫分析
試劑盒說明書 試劑盒說明書 試劑盒說明書 試劑盒說明書
本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用
產(chǎn)品編號 產(chǎn)品編號 產(chǎn)品編號 產(chǎn)品編號： ：： ：CSB-E04577h
檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍： ：： ：0.78 ng/ml - 50 ng/ml
zui低檢測限 zui低檢測限 zui低檢測限 zui低檢測限： ：： ：0.195 ng/ml
特異性 特異性 特異性 特異性： ：： ：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人 IFN-γ，且與其他相關(guān)蛋白無
交叉反應(yīng)。
有效期 有效期 有效期 有效期： ：： ：6 個月
預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用： ：： ：ELISA 法定量測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生
物液體中 IFN-γ含量。
說 說說 說明 明明 明： ：： ：  
1.  試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2.  濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。  
3.  中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
4.  剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對實
驗結(jié)果造成任何影響。 
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概述 概述 概述 概述： ：： ：
干擾素（IFN）是 1957 年被發(fā)現(xiàn)的。它是一類分泌性蛋白，具有廣譜抗
病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能。根據(jù)產(chǎn)生干擾素細胞來源不同、理化性質(zhì)和
生物學(xué)活性的差異，可分為 α-1b 型干擾素、β-干擾素和 γ 干擾素。γ 干擾素
（IFN-γ）也叫Ⅱ型IFN，主要由活化T細胞產(chǎn)生，活化NK細胞也可產(chǎn)生IFN-γ。
人 IFN-γ基因定位于 12 號染色體，在 DNA水平上 IFN-γ基因與 IFN-α/β 基因
無同源性。人 IFN-γ 成熟分子由 143 個氨基酸組成，糖蛋白，以同源雙體形
式存在，分子量為 40kDa。IFN-γ 的生物學(xué)作用有較嚴格的種屬特異性，人
IFN-γ只作用于人或靈長類動物的細胞。其生物學(xué)作用有：（1）誘導(dǎo)單核細胞、
巨噬細胞、樹突狀細胞、皮膚成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、星狀細胞等 MHCⅡ
類抗原的表達，使其參與抗原提呈和特異性免疫的識別過程。此外，IFN-γ可
上調(diào)內(nèi)皮細胞 ICAM-1（CD54）表達，促進巨噬細胞 FcγR 表達，協(xié)同誘導(dǎo) TNF
并促進巨噬細胞殺傷病原微生物。（2）促進 LPS 體外刺激小鼠 B 細胞分泌
IgG2a，降低 IgG1、IgG2b、IgG3 和 IgE 的產(chǎn)生；抑制由 IL-4 誘導(dǎo)的小鼠 B
細胞增殖，IgG1 和 IgE 產(chǎn)生以及 FcεRⅡ表達；促進 SAC 誘導(dǎo)的人 B 細胞的
增殖。（3）協(xié)同 IL-2 誘導(dǎo) LAK 活性，促進 T 細胞 IL-2R 表達。（4）誘導(dǎo)急性期
蛋白合成，誘導(dǎo)髓樣細胞分化。
實驗原理 實驗原理 實驗原理 實驗原理： ：： ：
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗 IFN-γ 抗體的微孔
中依次加入標本或標準品、*化的抗 IFN-γ 抗體、HRP 標記的親和素，
經(jīng)過*洗滌后用底物 TMB顯色。 TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，
并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 IFN-γ呈正相關(guān)。
用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。   
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試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制： ：： ：  
1.  酶聯(lián)板 酶聯(lián)板 酶聯(lián)板 酶聯(lián)板（Assay plate ）：                                                                   一塊 （96 孔）。   
2.  標準品 標準品 標準品 標準品（Standard）：                                                                  2 瓶（凍干品）。 
3.  樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液（Sample Diluent）：                                                      1×20ml/瓶。 
4.  *標記抗體稀釋液 *標記抗體稀釋液 *標記抗體稀釋液 *標記抗體稀釋液（ （（ （Biotin-antibody Diluent） ）） ）：                   1×10ml/瓶。 
5.  辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液（ （（ （HRP-avidin Diluent） ）） ）：    1×10ml/瓶。 
6.  *標記抗體 *標記抗體 *標記抗體 *標記抗體 （ （（ （Biotin-antibody） ）） ）：                             1×120l/瓶（1： 100）。 
7.  辣根過氧化物酶標記親和素 辣根過氧化物酶標記親和素 辣根過氧化物酶標記親和素 辣根過氧化物酶標記親和素 （ （（ （HRP-avidin） ）） ）：               1×120l/瓶（1： 100）。 
8.  底物溶液 底物溶液 底物溶液 底物溶液（ （（ （TMB Substrate） ）） ）：                                                        1×10ml/瓶。   
9.  濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液（ （（ （Wash Buffer） ）） ）：     1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋 25 倍。   
10. 終止液 終止液 終止液 終止液 （ （（ （Stop Solution） ）） ）：                                             1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 
需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材： ：： ：
1.  標準規(guī)格酶標儀
2.  高速離心機
3.  電熱恒溫培養(yǎng)箱
4.  干凈的試管和 Eppendof管
5.  系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6.  蒸餾水，容量瓶等
標本的采集及保存 標本的采集及保存 標本的采集及保存 標本的采集及保存： ：： ：  
1.  血清：全血標本請于室溫放置 2 小時或 4℃過夜后于 1000  x  g離心 20 分
鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍
融。 
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2.  血漿：可用 EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后 30 分鐘內(nèi)于 2  -  8° C
1000 x g離心 15 分鐘，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍
融。
3.  細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000  x  g離心 20 分鐘，取上清即可檢
測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注 注注 注： ：： ：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果 標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果 標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果 標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果， ，， ，因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測。 。。 。
標本的稀釋原則 標本的稀釋原則 標本的稀釋原則 標本的稀釋原則： ：： ：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。
只有稀釋至標準曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準確的。稀釋的過程中，應(yīng)
做好詳細的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應(yīng)再乘以“N”。 
標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則： ：： ：
2 瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至 1ml，蓋好后靜置 10 分鐘以上，然后
反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為 50  ng/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋
50 ng/ml， 25 ng/ml， 12.5 ng/ml， 6.25 ng/ml， 3.12 ng/ml， 1.56 ng/ml， 0.78 ng/ml，
樣品稀釋液直接作為標準濃度 0 ng/ml，臨用前 15 分鐘內(nèi)配制。
如配制 25  ng/ml 標準品：取 0.5ml（不要少于 0.5ml）50  ng/ml 的上述標準品
加入含 0.5ml 樣品稀釋液的 Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
*標記抗體的稀釋原則 *標記抗體的稀釋原則 *標記抗體的稀釋原則 *標記抗體的稀釋原則： ：： ：
臨用前以*標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所
需的總量配制（每孔 100l），實際配制時應(yīng)多配制 0.1-0.2ml。如 10l *
標記抗體加 990l *標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前
一小時內(nèi)配制。 
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辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則： ：： ：
臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的
每次實驗所需的總量配制（每孔 100l），實際配制時應(yīng)多配制 0.1-0.2ml。如
10l 辣根過氧化物酶標記親和素加 990l 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋
液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。
操作步驟 操作步驟 操作步驟 操作步驟： ：： ：
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻
時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品
稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1.  加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100l，
余孔分別加標準品或待測樣品 100l，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于
酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，
37℃反應(yīng) 120 分鐘。
為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2.  棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加*標記抗體工作液  100l（取 1l
*標記抗體加 99l *標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，
在使用前一小時內(nèi)配制），37 ,60 ℃ 分鐘。
3.  溫育 60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，
200l/每孔，甩干。  
4.  每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同*標記抗體工作液）
100l，37℃，60 分鐘。 
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5.  溫育 60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2 分鐘，
200l/每孔，甩干。
6.  依序每孔加底物溶液 90l，37℃避光顯色（ （（ （30 分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標
準品的前 3-4 孔有明顯的梯度藍色，后 3-4 孔梯度不明顯，即可終止）。
7.  依序每孔加終止溶液 50l，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加
入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底
物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8.  用酶聯(lián)儀在 450nm 波長依序測量各孔的光密度（OD值）。  在加終止液后
15 分鐘以內(nèi)進行檢測。
實驗備注 實驗備注 實驗備注 實驗備注
1.  用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到
管底。
2.  每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶
液及 2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào) OD值至零。  
3.  為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上
蓋或覆膜。
4.  未使用完的酶標板或者試劑，請于 2-8℃保存。標準品、*標記抗體
工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請
勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、*標記抗體工作液、或辣根過氧化物
酶標記親和素工作液。
5.  建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。 
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洗板方法 洗板方法 洗板方法 洗板方法： ：： ：
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上
鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少 0.3ml
注入孔內(nèi)，浸泡 1-2 分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算 計算 計算 計算： ：： ：
以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對
數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；
再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標準曲線的直線回歸方
程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即
為樣品的實際濃度。  
注意事項 注意事項 注意事項 注意事項： ：： ：
1.  當混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。
2.  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3.  一次加樣時間控制在 5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。 
4.  請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔。
5.  如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋
倍數(shù)。
6.  在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。 
7.  底物請避光保存。
8.  不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。  
 

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