實驗材料 DNA
試劑、試劑盒 乙酸鈉*TE無水乙醇dNTP反轉錄酶RNA酶洗脫液溴化乙錠
儀器、耗材 水浴鍋培養箱
實驗步驟
1. 用限制性內切核酸酶消化DNA以獲得目的DNA片段，將靶片段雙向克隆到M13噬菌體載體或含有M13復制起始子的質粒載體中。從100 ml 感染細抱培養物中提取單鏈DNA。
2. 在三個微量離心管內各加入40 μg 1 mg/ml 的單鏈DNA，如果靶序列的兩條鏈都要被利用，則需用6個反應。
3. 亞硝酸反應：在一個管內加入10 μl pH4.3的2.5 mol/l 乙酸鈉和50 μl 2 mol/l *，混勻，室溫溫育60 min。
4. 甲酸反應：在另一管內加60 μl 濃甲酸，混勻，室溫溫育10 min。
5. 肼反應：在第三個管內加60 μl 濃肼，混勻，室溫溫育10 min。
6. 毎管加100 μl 2.5 mol/l pH5.5的乙酸鈉，30 μg 擔體tRNA和1 ml 無水乙醇，置干冰中凍至-80℃，放置10 min，離心10 min，去上清，重復乙醇沉淀兩次，再用80 μl TE緩沖液重懸DNA。
7. 在重懸的DNA內加10 μl 4種dNTP混合液，10 μl 10×反轉錄酶緩沖液和100 pmol 的寡核苷酸引物。先在85 ℃溫育5 min，再于40℃溫育15 min。
8. 加10 μl 4種dNTP混合液和30~40 U 的AMV反轉錄酶，37℃溫育1 h。
9. 用緩沖液平衡酚抽提和乙醇沉淀DNA，DNA重懸于100 μl 10×限制性內切酶緩沖液，并用適當的限制性內切酶切割，以便從載體中回收片段。
10. 酚抽提和乙醇沉淀DNA。DNA重懸于10~15 μl 洗脫緩沖液，并加0.5 μl 2 mg/ml RNA酶A，37℃溫育15 min 以降解擔體tRNA。
11. 在非變性的6%聚丙烯酰胺凝膠電泳上，分離從載體上切下的目的片段，凝膠用溴化乙錠染色，切膠，洗脫出DNA。
12. 將純化的插入DNA連接到具有互補末端的質粒或細菌噬菌體載體中。通過常規的轉化程序將連接混合物導入合適的細菌中。
