實(shí)驗(yàn)方法原理 大多MDR細(xì)胞膜上出現(xiàn)MDR-1基因及其基因產(chǎn)物P-糖蛋白過(guò)度表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)材料 RNA
試劑、試劑盒 PBS氯仿異丙醇萘酸異硫氰酸肽十二烷基肌酸鈉構(gòu)櫞酸鈉乙酸鈉二疏基乙醇乙醇Taq酶
儀器、耗材 離心機(jī)紫外分光光度計(jì)瓊脂糖凝膠電泳PCR儀
實(shí)驗(yàn)步驟
一、細(xì)胞總RNA提取
1. 收集約5×107個(gè)細(xì)胞，冷PBS洗滌。
2. 加入400 ul RNA提取液（含6 mol/l 的異硫氰酸肽，0.5%十二烷基肌酸鈉，0.025 mol/l 構(gòu)櫞酸鈉pH7.0，0.25 mol/l 乙酸鈉，pH4.0，0.5%二疏基乙醇，50%萘酸），混勻。
3. 加入400 ul 氯仿，混勻，以13 000 r/min 于4℃離心15 min。
4. 取上清液加入等體積的異丙醇，4℃放置30 min。
5. 然后以13 000 r/min 離心15 min，吸上清，將RNA成點(diǎn)用75%的乙醇洗滌1次，溶于100 ul 的無(wú)菌雙蒸餾水中。
6. 并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度（A260/A280應(yīng)為1.8~2.0）后備用。
二、反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增
1. 引物
2. 取細(xì)胞總RNA10 ul 加入20 ul AMV逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系中，42℃保溫30 min 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。
3. 然后置95℃，3 min 終止反轉(zhuǎn)錄。
4. 接著在Taq酶的作用下，用mdr-1和β2-MG引物，對(duì)cDNA上的目的片段進(jìn)行PCR
5. 94℃預(yù)變性2 min，然后94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。
6. zui終在60℃保溫7 min，以保證產(chǎn)物充分延伸。
7. 取10 ul 擴(kuò)增產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下照相，與mdr-1 cDNA陽(yáng)性對(duì)照，等位的DNA條帶為陽(yáng)性，反之為陰性。
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