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DNA重組技術的基本過程

閱讀:176發布時間:2016-3-28

蛋白質工程介紹:

   基因的核苷菌順序決定了蛋白質中氨基酸的排列次序。在DNA重組技術等的基礎上,通過核苷酸缺失、插入、移位和替換等方式使基因突變,來構建人們期待的新基因,從而產生新的蛋白質(酶)已經為可能。此稱為蛋白質工程。

例如,一個蛋白質中特定的氨酸要突變成肽氨酸,只要制備得到這個蛋白質的基因或是cDNA基因,又知道要突變的部位及其鄰近的堿基順序,就能實現這種突變。已知*是由TCT編碼若把C突變成G,就變成半肽氨酸的密碼TGT。為此,用人工合成一段寡聚核苷酸引物,引物里除含有TGT外,其余核苷酸均與基因部分互補。打開含有被突變蛋白質基因的雙條鏈,用引物與之互補鏈退火(加入退火在適宜溫度下進行,約15個堿基中,有一個堿基錯配是可以容忍的)。由DNA聚合酶延伸、克隆所得鏈轉入宿主細胞復制,即產生兩種子代DNA。一種順序中含有TCT順序,另一種含有TGT順序。表達具有TGT順序的DNA,既可以產生在*部位上半肽氨酸代替*的蛋白質,原則上應用這種寡聚核苷酸誘導突變的方法可以生產任何特定的蛋白質(酶)。

據1991年至1992年“Science”統計,在全文報道的13個蛋白質晶體中,有9個是基因克隆表達的蛋白,占總數的69%。這一情況表明:基因表達和定點突變等技術有機地結合將產生更多的新功能蛋白質。應用定點突變還可以了解蛋白質是如何折疊、如何識別其他分子以及如何催化反應和如何加工等結構與功能。

由于DNA的核苷酸順序比蛋白質的氨基酸順序易測定,所以可以通過測定基因的核苷酸順序,來推導蛋白質的氨基酸順序,并預測可能的空間結構。蛋白質的結構是生物功能的基礎。過去測定蛋白質順序是十分困難的,乳S.Sanger用了十年的時間,于1953年才報道了胰島素的全部氨基酸排列順序。根據蛋白質數據庫(PDB)統計,自1959年測定肌紅蛋白的空間結構以來,到1988年以前的30年間,蛋白質空間結構測定總數大約是300個。幾乎是10年一個。直到DNA重組技術等新技術出現后的1988年,結構的預定速度增長到100個/年;隨后以驚人的速度發展,到1990年接近1個/d,1995年達到3.5/d。所以,生命科學自20世紀90年代以來,迎來了結構生物學的時代。所謂結構生物學即是以生命物質的空間結構及其運動為基礎,來闡明生命活動和生命現象本質的科學。

應該說,DNA重組技術、PCR、定點突變等技術已在核酸和蛋白質兩大分子物質研究之中架起了一座橋梁。生物化學家,現在可以在基因和蛋白質兩個研究領域之間“自由走來走去”。從基因和cDNA的分析中,可以發現以前不知道的蛋白質的存在,并將它們分離和純化出來。相反,純化一種蛋白質可以找到它的基因或cDNA基因。因為現在有了微量化學技術和基因克隆擴增技術(包括PCR技術),只要有微量的蛋白質和核酸就足夠了。

第四節、體細胞克隆技術

  1997年“Nature”雜志報道,英國學者I.Wilmut等人從一只胚胎羊中取出乳腺上皮細胞進行培養(供體),再用另一母羊的卵母細胞(受體)摘出細胞核后,與上述乳腺上皮細胞進行體外融合。融合體經培養后,植入受體母羊的子宮中,結果發育并分娩出一頭小羊“多利”。由于這頭小羊不是由受精卵發育而成的,而是由體細胞核(乳腺細胞)在卵細胞中無性繁殖而成,所以稱為“克隆羊”。形成的個體具有供體所具有的特征。

     這是20世紀90年代生物科學震驚世界的成就。它表明成熟的體細胞可以不經過有性繁殖而發育成個體,這在過去是認為不可能的。其潛在的誘惑力在于既然可以克隆羊,是否也可以克隆其他動物,以至人自身。其前景不僅在生物學界,也在社會學、人類學、倫理學界引起了廣泛的重視和爭論。自那以后,世界范圍內先后成功地克隆出了牛、馬、猴、狗等動物。有的克隆動物,如牛還有了后代。然而,這項技術還有待成熟(多利三年后死亡),許多克隆動物的生長發育及特性還有待研究、重復驗證。但這項技術在生物學上的確是了不起的事件,如果將這項技術用于挽救一些瀕臨滅絕的物種等方面,其價值將是不可估量的。


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