基因組測序讓我們意識到，人類基因組只有一小部分被翻譯成蛋白質。其實我們基因組的80%會轉錄成RNA，但這些轉錄本大多不生成蛋白質。近年來人們發現非編碼RNA往往與人類疾病有關，不過絕大多數非編碼RNA的功能還是未知的。CRISPR/Cas9在這方面可以起到重要的作用。

CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR抑制（CRISPRi）特別適合分析非編碼RNA的具體功能。雖然越來越多的研究人員開始使用CRISPRa和CRISPRi，但它們其實還剛出爐不久。

zui近The Scientist雜志聯合CRISPR的和使用者共同編寫了使用CRISPRa和CRISPRi的入門指南，幫助研究者們更好的研究和調節基因組的編碼和非編碼區域。

如何進入細胞

把Cas9蛋白送入細胞并不是一件容易的事，尤其是CRISPRi和CRISPRa中的改良Cas9。對于CRISPRa來說，構建始終表達Cas9或誘導表達Cas9的突變小鼠可以解決這個問題。此外，截短的引導RNA也不難進入小鼠。14或15bp的引導RNA能包裝進病毒（腺相關病毒AAV更好），進而注射到小鼠體內。這種短RNA不能使Cas9剪切DNA，但可以招募轉錄激活子。

事實上研究者們已經發現了更小的Cas9。過去我們常用的是釀膿鏈球菌Cas9，其實*Cas9要小得多，可以包裝到AAV并進入細胞。雖然*Cas9靶標的位點要少一些，但對于轉錄激活來說這并不是什么大問題。

測試多少引導RNA

與編輯蛋白編碼基因所用的sgRNA（約20nt）相比，研究非編碼RNA需要測試更多的sgRNA。Bassett進行基因編輯的時候通常設計三個引導RNA，但在CRISPRi中他會準備5-20個引導RNA。在轉錄起始位點*–200bp的區間中，我會盡可能多的嘗試。預測脫靶效應的計算工具可以幫助我們縮小引導RNA的選擇范圍。

用CRISPRa研究非編碼RNA需要測試的sgRNA就更多了，因為偏愛非編碼轉錄本的sgRNA并不那么好找。可能我們所知的轉錄起始位點對非編碼RNA來說并不是那么合適。也可能非編碼RNA就是更難激活。