革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：

1）涂片固定。

2）草酸銨結晶紫染1分鐘。

3）自來水沖洗。

4）加碘液覆蓋涂面染約1分鐘。

5）水洗，用吸水紙吸去水分。

6）加95%酒精數滴，并輕輕搖動進行脫色，20秒后水洗，吸去水分。

7）蕃紅染色液（稀）染1分鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。

革蘭氏染色法鑒定原理：該染色法所以能將細菌分為G+菌和G-菌，是由這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。G-菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質，增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細菌就被脫色，再經蕃紅復染后就成紅色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高，類脂質含量少，經脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色，呈現藍紫色

其重要的臨床意義在于：1.鑒別細菌 2.選擇藥物 3.與致病性有關：革蘭氏陽性菌能產生外毒素，革蘭氏陰性菌能產生內毒素；而內毒素主要是指革蘭氏陰性菌胞壁成分中的脂多糖，兩者的致病作用不同。