小鼠干細(xì)胞因子純化活性測(cè)定又稱(chēng)為肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子、c-kit配 體。天然SCF是分子量約為18. 5KD的酸性糖蛋白,它是由骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。 其與c-kit的結(jié)合,可調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞、肥大細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和生殖細(xì)胞和增 殖,生長(zhǎng)、分化和移行等生理功能。該因子可用于治療貧血,并在骨髓移植、基 因治療、體外造血干細(xì)胞培養(yǎng),干細(xì)胞移植和抗輻射損傷等工作中有廣泛應(yīng)用。 在種屬特異性方面,人和小鼠的SCF的同源性達(dá)83%。雖然人SCF對(duì)小鼠造 血干細(xì)胞的增殖影響不大,但小鼠SCF（mSCF）對(duì)人造血干細(xì)胞的作用卻與人SCF 相似。天然的SCF主要由山骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生,來(lái)源少,難以大規(guī)模純化。但是由 于SCF的生物學(xué)活性不依賴(lài)于糖基化,因此原核表達(dá)系統(tǒng)是一種提供大量SCF的 有效手段 本研究取發(fā)育至十天左右的小鼠胚胎,研碎后提取總RNA,采用 RT-PCR方 法從小鼠胚胎總RNA中獲得小鼠SCF的cDNA,并克隆入pGEM-T內(nèi)成pGEM-T-SCF。 用BamHI和Xhol將mSCF cDNA從pGEM-T-SCF內(nèi)切出并克隆入pGEX-4T-3內(nèi) 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）基因的下游成表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-3-SCF,將 pGEX-4T-3-SCF轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后,在0. 5mMTPTG和35℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)。 誘導(dǎo)菌體的裂解物經(jīng)12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGF）后,確定為預(yù) 期的53KD的融合表達(dá)條帶,用山羊抗GST抗體進(jìn)行Western-blot試驗(yàn),結(jié)果確 證了融合蛋白的表達(dá)。 誘導(dǎo)H.菌液,細(xì)菌經(jīng)超聲破碎后離心取上清,通過(guò) Glutathione Sepharose-4B親和吸附融合形式的重組小鼠干細(xì)胞因子（rmSCF）,用凝血酶在 柱上直接酶切,zui后用5倍柱體積的PBS將rmSCF洗下,結(jié)果獲得純度約為80% 的rmSCF,rmSCF為27KD。由于獲得的rmSCF中含有一定量的GST和其它雜蛋白 （部分是融合形式的GST-rmSCF）,將rmSCF重新進(jìn)行（Glutathione Sepharose-4B 親和層析以去除其中的GST和GST-rmSCF蛋白,經(jīng)5次親合后rmSCF的純度可 達(dá)85%。為了進(jìn)一步提高純度,用Q-Sepharose柱對(duì)親合純化獲得的rmSCF進(jìn)行 了離子交換層析,平衡液為10mmol/LTris-HCL,pH7. 2,梯度洗脫液為 10mmol/LTris-HCL,pH7. 2和1 mol/LNaCL。經(jīng)梯度洗脫,當(dāng)鹽濃度在0. 36mol/L 時(shí)可將rmSCF洗脫下來(lái),緊接著分別用截留分子量為10000D和30000D的超膜膜 對(duì)離子交換層析后獲得的rmSCF進(jìn)行超濾,這樣下來(lái),rmSCF的純度可達(dá)90%以 上。 用rmSCF協(xié)同rhGM-CSF刺激人骨髓細(xì)胞集落形成的方法檢測(cè)rmSCF的活性, 結(jié)果表明,當(dāng)分別用50 ng/ml,100 ng/ml及200 ng/ml的rmSCF的協(xié)同作用的。