1 配液：ELISA試劑盒將50ml濃縮洗刷液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋至1000ml備用。

2 編號：將樣品對應微孔按序編號，每板設陰性對照3孔、陽性對照Ⅰ型、Ⅱ型各1孔，空白對照1孔。

3 加樣：分別在相應孔加入待檢標本、陰性、陽性對照100μl，用封板膜封板后置37℃溫育30min。

4 洗刷：當心把封板膜揭去，用洗板機挑選5次程序，洗板后拍干。 

5 加酶：每孔加酶結合物100μl（空白對照孔除外），充沛混勻，用封板膜封板后置37℃溫育30min。

6 洗刷：當心把封板膜揭去，用洗板機挑選5次程序，洗板后拍干。

7 顯色：每孔加入顯色劑A液和B液各50μl，悄悄振動混勻，封板后置37℃避光顯色15min。

8 測定：每孔加終止液50μl，悄悄振動混勻。設定酶標儀波長為450nm（建議使用雙波長的酶標儀比色，參閱波長630 nm），空白調零，讀取各孔OD值。

9 判斷成果：核算臨界值（cut-off）（CO）值。 臨界值＝陰性對照A均值＋0.12 正常情況下，陰性對照孔的OD值≤0.10（若1孔陰性對照的OD值＞0.1應放棄，若有2孔或2孔以上陰性對照的OD值＞0.1，應重復實驗。）。樣品OD值＜臨界值者為HIV抗體陰性。

正常情況下，陽性對照孔的OD值≥0.80（若1孔陽性對照的OD值＜0.8應放棄，若有2孔或2孔以上陽性對照的OD值＜0.8，應重復實驗。樣品OD值≥臨界值者為HIV抗體陽性。 

ELISA試劑盒注意：關于篩查陽性標本，應從頭取樣雙孔復試，復試陽性者應按照《全國HIV檢測管理規范》送HIV確證實驗室進行確證實驗。 質量操控： 每塊板設陰陽性及空白對照，并于每次實驗用克己質控血清作質控，將質控血清孔OD值采用“即刻法"核算或標在質控圖上，如質控有效，標明實驗牢靠；如失控，則要查看試劑效期、貯藏溫度、試 驗溫度是否正常、操作過程是否正確，直至從頭實驗使其在控。