酶聯(lián)免疫斑點檢測（Enzyme-Linked Immunospot Assay，ELISPOT）可以分解成“酶聯(lián)免疫"和“斑點"兩部分。“酶聯(lián)免疫"與ELISA中的含義相同，都是指基于酶促放大反應(yīng)的免疫學(xué)檢測。與ELISA一樣，ELISPOT的抗體也是包被于固體載體上，所不同的是：ELISA抗體捕獲的抗原來自樣品溶液中已經(jīng)存在的、均勻分布的抗原分子，而ELISAPOT抗體捕獲的抗原來自樣品細胞在檢測當(dāng)時新鮮分泌的抗原分子；ELISA顯示出來的是或深或淺的有色溶液，而ELISAPOT顯示出來的是沉積在固體基板上或多或少的有色斑點，這也是ELISPOT一詞中“斑點"的來歷。

    ELISA檢測的是無生命的溶液中抗原分子的濃度，ELISPOT檢測的是有生命的活細胞分泌抗原的功能。即將不同來源的一定量的細胞加至已包被抗細胞因子抗體的固相微孔板內(nèi)，同時加入細胞刺激劑，經(jīng)培養(yǎng)一定時間，洗去細胞，再加入酶標(biāo)抗體，與被測細胞分泌的細胞因子反應(yīng)，zui終通過ELISPOT檢測儀讀取斑點數(shù)。此法可測定一定屬靈的細胞所分泌的細胞因子的量。

試劑與器材

實驗培養(yǎng)器材：超凈工作臺、5%CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱等。

ELISPOT試劑盒：包括包被抗體、檢測抗體、親和素、封閉液、稀釋緩沖液R（10×）、Tween20、顯色液存儲液以及膠囊等。

Biosys Bioreader 4000 PRO自動讀板儀。

P20，P200，P1000微量移液器及槍頭。

0.5ml及1.5ml Eppendorf管。

抗原或促有絲分裂原。

操作步驟

未包被板ELISPOT技術(shù)主要包括抗體包被、細胞加板和斑點顯色三大步驟。

一、抗體包被

1、潤濕：在未包被ELISPOT板每孔中加入15μl包被緩沖液預(yù)濕。

2、包被：潤濕之后，無需洗滌。每孔加入50μl PBS稀釋好的包被抗體（濃度為10μg/ml），4℃包被過夜。

3、封閉：次日傾倒包被液，用PBS洗滌2次。zui后一次，在滅菌的吸水紙上拍干。200μl/孔加入用1×PBS稀釋好的封閉液，37℃封閉1h或室溫封閉2h。

4、傾倒封閉液，無需洗滌，直接加入檢測細胞進行ELISPOT檢測。

二、細胞加板

1、取出封閉好的板，準(zhǔn)備加入細胞。如果是以前封閉的板，先加入200μl RPMI-1640培養(yǎng)基室溫靜置10min，然后傾倒。

2、細胞加板：按照實驗設(shè)計，接種不同濃度的細胞，100μl/孔，每一樣本建議做雙復(fù)孔。同時設(shè)陽性對照和陰性對照。

3、加刺激物：把刺激物配成10×工作液，實驗孔每孔加入10μl。陽性對照孔加入10μl PHA，終濃度1-4μg/ml，該濃度能有效刺激IFN-γ的分泌。陰性對照孔不加任何刺激物。

4、加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入二氧化碳培養(yǎng)箱看，37℃培養(yǎng) 18-24h。

注意以上步驟均應(yīng)無菌操作

三、斑點顯色

1、裂解細胞：傾倒孔內(nèi)的細胞及培養(yǎng)基，每孔加入冰冷的去離子水200μl，4℃ 冰浴10min（低滲裂解細胞）。

2、洗滌：每孔加入200μl PBST，洗滌5次，zui后一次，在吸水紙上扣干。

3、加檢測抗體：每孔加入100μl稀釋好的*標(biāo)記檢測抗體，37℃孵育1h。

4、同2進行洗滌。

5、加酶標(biāo)親和素：每孔加入100μl稀釋好的酶標(biāo)親和素，37℃孵育1h。

6、同2進行洗滌。

7、顯色：用100ml 30%乙醇溶解底物緩沖液膠囊，然后加入3.3ml AEC儲存液，混合均勻后立即分裝，每支10ml，-20℃保存。每孔加入100μl的顯色液，室溫或者37℃ 靜置15-45min（在20-25℃顯色25min或者37℃顯色15min較合適），注意避光。

8、洗滌晾干：待斑點生長到合適的大小之后，以去離子水洗滌2編，終止顯色過程。將板倒扣在吸水紙上，拍干細小的水珠，之后去下保護層，放在通風(fēng)的地方，室溫靜置10-30min，讓膜自然晾干。注意不要將板放在烤箱內(nèi)，防止膜發(fā)脆、破裂。

9、將ELISPOT板置于Biosys Bioreader 4000 PRO自動讀板儀內(nèi)，調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)，斑點計數(shù)，并記錄斑點的各種參數(shù)，做統(tǒng)計分析。

注意事項

1、細胞加入前應(yīng)*洗干凈，避免帶入外源性細胞因子。

2、加板時細胞在孔中的分布要盡量均勻，要訣是加入細胞之后，不要再振動或者拍擊ELISPOT板。有人認為拍擊板子會讓細胞更分散，實際情況恰恰相反。同樣加完刺激物后也不要在拍擊ELISPOT板。

3、ELISPOT是通過計數(shù)形成的斑點數(shù)來判定結(jié)果，斑點數(shù)的多少應(yīng)該能真實反映實驗對象的客觀情況。為了使實驗的統(tǒng)計學(xué)意義顯著，斑點數(shù)目不宜太少；但為了使實驗結(jié)果便于計數(shù)，斑點數(shù)目也不宜太多。一般來說，實驗孔的斑點數(shù)目。而對照孔的斑點數(shù)目應(yīng)該越少越好，不要超過10ge，否則要提高檢測細胞的質(zhì)量，讓細胞保持較好的狀態(tài)與活力。