本期主題為“水稻基因組DNA的 southern雜交與非放射性ECL直接核酸標記及檢測"，主要是滿足初學者對Southern雜交的了解。 Southern雜交的新手們不妨參考下。

【實驗目的】

通過本實驗學習和掌握Southern轉膜、辣根過氧化物酶直接標記探針、Southern雜交及增強化學發光(ECL)檢測分子雜交結果的過程。

【實驗原理】

Southern雜交是一項在復雜的背景基因中識別特異性DNA序列的重要技術之一，它是Southern于1975年*的雜交方法。其基本原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈DNA在一定的條件下可按堿基互補原則(A=T,C=G)形成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸序列及標記的探針。此雜交過程是高度特異性的。

ECL直接核酸標記及檢測系統用辣根過氧化物酶(HRP)直接標記探針。該法用帶正電荷的核酸標記試劑(經修飾成為帶正電荷的HRP聚合體：HRP—對苯醌—聚乙烯亞胺復合物)與變性過的、帶負電荷的單鏈核酸探針松散連接，然后加入戊二醛，在戊二醛的化學交聯作用下與帶負電荷的單鏈DNA共價結合，從而標記DNA。標記的探針DNA與膜上的單鏈DNA雜交形成雙鏈DNA，探針上的HRP在H2O2存在下，催化H2O2還原，同時使魯米諾氧化并伴隨藍光產生，在增強劑的作用下使產生的光加強，從而可在X光片上檢測。

首先將經限制性內切酶酶解的DNA片段，經瓊脂糖凝膠電泳分離以及在凝膠上經NaOH處理使之變性，然后將尼龍膜(Hybond-N+)放在凝膠上，使之按原有順序將條帶轉移至膜上并固定起來，這是Southern轉膜過程。

Southern膜雜交是將吸附并固定在Hybond-N+尼龍膜上的dna片段與一個標記的探針雜交，zui后經過顯影從X光片上顯現出雜交分子的區帶。

本實驗中，經瓊脂糖凝膠電泳分離的水稻基因組DNA酶切產物，通過Southern轉移，將其吸印在Hybond-N+尼龍膜上，通過辣根過氧化物酶直接標記探針，與膜上的水稻DNA進行雜交，再用增強的化學發光方法得到分子雜交結果。

本實驗所用的探針來源于水稻和大麥，具有抗病基因NBS-LRR結構特點的DNA探針，因此水稻DNA和探針之間有較好的同源性，可得到雜交帶，可滿足初學者對Southern雜交方法進行訓練。

【儀器、材料與試劑】

(一) 儀器

恒溫水浴器 烤箱 臺式高速離心機

瓊脂糖凝膠電泳系統 高壓滅菌鍋 -70℃或-20℃冰箱

(二)材料

限制性內切酶 ECL試劑盒 氯化鈉(NaCl)

檸檬酸鈉 鹽酸(HCl) 氫氧化鈉(NaOH)

蔗糖 硼酸 溴酚藍

十二烷基硫酸鈉(SDS) 顯影粉 定影粉

溴化乙錠(EB) 20μl, 100μl, 1000μl微量加樣器及吸頭，小指管

Whatman 濾紙及普通濾紙 10 cm×5 cm玻璃板 尼龍膜(Hybond-N+)

衛生紙(或吸水紙) 裁紙刀 雜交盒

500g重物 X光片夾及X光片 剪子、鑷子、刀片、膠帶

保鮮膜 一次性手套

(三)試劑

1. 20×SSC(1000 mL)：3 mol/LNaCl(175.32g);0.3 mol/L檸檬酸鈉(88.26g)，用1 mol/LHCl調至pH7.0

2. 變性溶液(500mL)：1.5 mol/LNaCl(43.83g);0.5 mol/LNaOH(10g)

3. 中和溶液(500mL)：1.5 mol/L NaCl(43.83g);0.25 mol/L NaOH(5g)

4. 5×TBE(250 ml)：13.5g Tris，6.9 g硼酸，0.9g EDTA-Na2，用蒸餾水定容至250 ml

5. TE(10mL)：10 mmol/LTris-HCl;1 mmol/LEDTA pH8.0

6. 0.25 mol/LHCl(500 mL)

7. 6×溴酚藍載樣液(1mL)：0.25%溴酚藍;40%蔗糖

8. EB染色液：0.5 μl/L 溴化乙錠

【實驗步驟】

(一)基因組DNA的提取(略)

(二)樣品的限制性酶切及酶切效果檢查

1. 在1.5 ml 離心管中加入5 mg 基因組DNA進行限制性酶切;加入1/10終體積的10×反應緩沖液和50U限制酶(如Dra I)。加ddH2O至酶切反應終體積。將反應物按照廠商說明在適當溫度溫育(如37℃下反應)。

2. 取10%或更少體積已酶解的溫育混合物，用0.5×TBE緩沖液于0.8%瓊脂糖膠上進行電泳，片段分開及染色后，可見DNA彌散帶。部分酶解的樣品DNA在膠的頂端可見一條未酶解的帶，已酶解的DNA彌散帶亮度較弱。根據不同道上彌散帶亮度，調節DNA量以確保有等量的DNA進行電泳。

(三)Southern轉移(以下操作要戴上一次性手套)

1. 將酶解的DNA樣品小心加入0.8%瓊脂糖膠的加樣孔中。各取20ng 1Kb plus和Control DNA (HindIII酶切的λDNA)梯度標準參照物，分別與6×加樣緩沖液混勻后加入*與zui后一個加樣孔中。以25V電泳24~48 h。

2. 將瓊脂糖膠浸入0.25 mol/L HCl溶液中10 min(至溴酚蘭由藍色變桔黃色)，使DNA脫嘌呤。

3. 將膠浸入變性液(0.5 mol/L NaOH、1.5 mol/L NaCl)中變性30 min，使DNA雙鏈變性成單鏈。

4. 將膠浸入中和液(0.25 mol/L NaOH、1.5 mol/L NaCl)中平衡20 min。

5. 準備一個供DNA從膠上向尼龍膜轉移的玻璃平臺。將一張0.2um的Hybond-N+尼龍膜(英國Amersham公司生產)和一張濾紙切成與待轉移膠相同大小，另將一張濾紙切成與膠相同寬度，長度較長足以達到盛轉移液盒子的底部。

6. 將較長的濾紙在轉移液(0.25 mol/L NaOH、1.5 mol/L NaCl)中浸濕后置于平臺上，兩端浸入轉移液中(使溶液不斷地吸到濾紙上)。將膠置于濾紙上部，用玻璃棒仔細趕掉凝膠與濾紙間的氣泡，用鑷子將Hybond膜置于膠上并用玻璃棒趕掉Hybond膜與凝膠間的氣泡，將剩下的濾紙在轉移液中浸濕后置于膜上，再次趕盡氣泡。放一疊衛生紙(與尼龍膜同樣大小，約1000g)壓在濾紙上部，再放相同尺寸的玻璃板，zui后放一重物(約500g)在玻板上，讓凝膠上的DNA轉移12h或。

7. 將尼龍膜與凝膠剝離，凝膠用EB染色后觀察(膠上應無桔黃色熒光條帶，說明DNA轉移*)。棄去膠，把尼龍膜浸在6×SSC溶液中，約5min后取出。

8. 將尼龍膜夾在4層普通濾紙中，置80℃烘箱中烤2 h，使已轉移的DNA與膜交聯。

(四)探針標記

DNA探針采用具有抗病基因NBS-LRR結構特點的探針(可通過PCR擴增制備)，用ECL系統(英國Amersham公司生產)進行標記。取所需標記的DNA探針于95℃變性5 min，冰浴5 min;然后加入與探針等體積的DNA標記試劑(帶正電荷的辣根過氧化物酶聚合體)和化學交聯劑戊二醛溶液;混勻并短暫離心后37℃保溫10 min，放于冰上備用。

(五)Southern雜交

1. 將已烘烤過的膜放入雜交盒中，加入預熱的含有0.5mol/L NaCl和5%封閉試劑的雜交液(英國Amersham公司生產)，使雜交液剛好沒過尼龍膜，置于42℃預雜交1h(預雜交的目的是防止標記的探針與尼龍膜非特異性結合，從而使背景更清晰)。

2. 加入已標記的探針，混勻后于42℃雜交(變性探針與膜上的特異性序列雜交)。

3. 棄雜交液，以55℃初洗液(0.4% SDS, 0.5×SSC)漂洗兩次，每次10min，棄初洗液后，用2×SSC再漂洗兩次，各5 min(洗膜目的是將尼龍膜上未與DNA雜交的及非特異性雜交的探針分子從膜上洗去)。

4. 尼龍膜稍作吸印或晾干過多的漂洗液后，加等量的觀察液1(H2O2)和觀察液2(魯米諾及增強劑)處理膜1分鐘。

5. 移去過多的觀察液，用保鮮膜包好尼龍膜，置于X光片夾中。

6. 在尼龍膜上壓上X光片曝光1-2小時(在暗室中進行)。

7. 沖洗X光片(顯影一水洗一定影)，分析雜交條帶。所得數據用統計軟件進行聚類分析。