質粒DNA重組DNA

LB培養基蒸餾水IPTGX-gal氨芐*

旋渦混合器微量移液取樣器移液器吸頭離心管雙面微量離心管架干式恒溫氣浴恒溫水浴鍋制冰機恒溫搖床培養皿超凈工作臺酒精燈玻璃涂棒恒溫培養箱

一、實驗材料準備 

1.  器材

旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5 ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），制冰機，恒溫搖床，培養皿（已鋪好固體LB-Amp），超凈工作臺，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養箱。

2.  試劑

培養基（不加抗菌素），LB培養基（加抗菌素），無菌ddH₂O，IPTG，X-gal。

3.  材料處理

無菌ddH₂O，1.5 ml 離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。

二、操作步驟

1.  事先將恒溫水浴的溫度調到42℃。

2.  從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管（100 μl）感受態菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10 min。

3.   加入5 μl 連接好的質粒混合液（DNA含量不超過100 ng），輕輕震蕩后放置冰上20 min。

4.  輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2 min進行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3~5 min。

5.  在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500 μl LB培養基（不含抗菌素）輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1 h。

6.  在超凈工作臺中取上述轉化混合液100-300 μl，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養皿中，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

7.  如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2% X-gal，8 μl 20% IPTG，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

8.  在涂好的培養皿上做上標記，先放置在37℃恒溫培養箱中30~60 min 直到表面的液體都滲透到培養基里后，再倒置過來放入37℃恒溫培養箱。

9.  在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗報告。

10.  觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。

1.  玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂。