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技術文章

血清脂蛋白的快速離心分離法

閱讀:350發布時間:2015-1-5

利用不同容量的角式轉頭及很容易配制的梯度液,在各種型號的超速離心機上都能得到滿意的分離結果。下面舉了幾個分離實例,實際上還可以應用于各種型號各種容量的固定角式轉頭。

(一)   梯度液

A液:11.40gNacl,0.1g EDTA-Na2,置于1000ml量筒中加入500ml重蒸水及1

ml 1N NaOH,混勻至全部溶解。加重蒸水至1000mlzui后再加3ml重蒸水(Nacl:0.195mol)。終密度1.006g/cm3,PH10.37。

B液:加24.98g NaBr 到100ml A液中。終密度1.182g/cm3。(Nacl:0.195mol, NaBr:7.65mol),PH9.72。

C液:加78.32g NaBr 到100ml A液中。終密度1.478g/cm3。(Nacl:0.195mol, NaBr:7.65mol),PH8.86。

(二)   離心機及轉頭

? 離心機:Hitachi CP-MX系列超速離心機或其他類似機組。

Hitachi CS-150GXL微量超速離心機。

? 轉頭,離心管;S 140 AT:140,000rpm,1,050,000×g,10×2ml,K=5,1PC厚壁管。

S 80 AT3:80,000rpm,415,000×g,8×8ml,K=23,6PC厚壁管。

S 70 AT:70,000rpm,505,000×g,8×40ml,K=44,40PA管。

(三)   血漿-血球分離:

全血,角轉頭或甩平轉頭3000rpm×20min,沉淀為血細胞,上清血漿待用。

(四)   乳糜粒分離:

      ? 離心參數:各種轉頭均可用,4×106(g×min),10℃

? 梯度液:離心管下部3/4容積為血漿,上部1/4容積為0.15MNacl+0.3MEDTA。PH7.4。

? 離心結果:乳糜粒上浮,離心管傾斜,吸管貼管壁慢吸出(約占血漿容積的2~6%。禁令12小時以上供血者血漿中乳糜含量很低,食后供血者含量較高。

(五)   血清脂蛋白分離:

(ⅰ)VLDL分離(ρ<1.006g/cm3

轉頭

離心管內液體分布

離心參數

結果

S140AT

(CS-150GXL機組)

下部600μl血漿

上部300μl A液

140,000rpm×50min

16℃

加速:5

減速:7

可見明顯分層上部約1/3VLDL吸出

S80AT3

(CS-150GXL機組)

下部3.4ml血漿

上部1.7mlA液

80,000rpm×4.5hrs

16℃

加速:5

減速:7

同上

P70AT

(CP-MX機組)

下部24ml血漿

上部11.7ml A液

70,000rpm×8hrs

16℃

加速:5

減速:7

同上


















(ⅱ)LDL(含IDL)分離(1.006g/cm3<ρ<1.063g/cm3


轉頭

離心管內液體分布

離心參數

結果

S140AT

(CS-150GXL機組)

*次離心后上部VLDL取出,下部600μl移入另一離心管,加入300μl B液,充分混合

140,000rpm×80min

16℃

加速:9 減速:7

上部1/3體積LDL+IDL吸出

S80AT3

(CS-150GXL)

*次離心后上部VLDL吸出,,下部3.4ml移入另一離心管,加入1.7ml B液并充分混合

80,000rpm×5.5hrs

16℃

加速:9減速:7

同上

P70AT

(CP-MX系列超速機或類似機型)

*次離心后上部11.7ml吸出,下部約24ml 移入另一離心管,加入11.7ml B液,充分混合

70,000rpm×10hrs

16℃

加速:9 減速:6

同上


(ⅲ)HDL分離(1.063g/cm3<ρ<1.21g/cm3


轉頭

離心管內液體分布

離心參數

結果

S140AT

(CS-150GXL機組)

第二次離心后吸出上部300μl后,下部600μl移入另一離心管,加入300μl  C液,充分混合

140,000rpm×140min

16℃

加速:9

減速:7

可見較明顯分層,

上部為HDL,下部為血清白蛋白及球蛋白

S80AT3

(CS-150GXL機組)

第二次離心后吸出上部約1.7ml、下部3.4ml移入另一離心管,加入1.7ml C液,充分混合

80,000rpm×8小時

16℃

加速:9

減速:7

同上

P70AT

(CP-MX系列機或其他類型機組)

第二次離心后吸出上部1/3、下部2/3移入另一離心管,加入約12ml C液,充分混合

70,000rpm×15小時

16℃

加速:9

減速:6

同上


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