酸性磷酸（酯）酶活性測(cè)定方法
1．目的要求
掌握酸性磷酸（酯）酶活性測(cè)定的原理和方法。
2．方法原理
酸性磷酸（酯）酶是一種存在于生物體內(nèi)水解有機(jī)磷酸酯鍵的酶。以對(duì)硝基酚磷酸鈉作為底物，在酸性磷酸酯酶的作用下，在堿性條件下水解生成黃色的對(duì)硝基酚，可用分光光度計(jì)進(jìn)行比色測(cè)定。它們?cè)诟黝惙N子中普遍存在，且含量較多，在萌發(fā)前期，隨著種子的萌發(fā)進(jìn)程活性增加，通常酸性磷酸酶活性與種子活力呈正比。
3．主要實(shí)驗(yàn)儀器及材料
干種子或吸脹種子、電子天平、分光光度計(jì)、恒溫水浴箱、帶塞刻度試管、小燒杯、研缽、塑料管、剪刀。
4．掌握要點(diǎn)
掌握常用的測(cè)定酸性磷酸（酯）酶活性的方法——對(duì)硝基酚磷酸鈉法。
5．實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
（1）酶液提取。稱取1g樣品，用5mL研磨緩沖液在研缽中冰浴研磨成漿，再用5mL研磨緩沖液沖洗，轉(zhuǎn)移至離心管中，在20000rpm下離心10min。吸出上清液，即為酶粗提液。可放在冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/span>
（2）活力測(cè)定。取酶液0.1—1mL（視酶含量多少而定），加水至1mL，然后加入緩沖液1mL和對(duì)硝基酚磷酸鈉溶液0.1mL。空白對(duì)照用1mL研磨緩沖液代替酶制劑。充分混勻后，放在30℃恒溫箱中保溫10min，時(shí)而搖動(dòng)。10min后，加入1m0.5mol/LNaOH溶液，充分混合，終止反應(yīng)，并使對(duì)硝基酚呈黃色。在400nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度A。
（3）計(jì)算酶活性，以每毫克種子每分鐘水解底物的nmol數(shù)表示。
酶活性nmol/min.mg式中0.019為pH=14時(shí)，對(duì)硝基酚的µmol吸光系數(shù)，即對(duì)硝基酚的濃度為1mol/L時(shí)，其A=0.019；
3.1為0.0031×1000，反應(yīng)混合液的體積為3.1，將µmol化為nmol乘上1000；
V為酶制劑總體積；
V1為每次用酶體積。
在實(shí)驗(yàn)中要保持酶制劑處于低溫下以免酶活性下降，可在冰箱中提取和保存。
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