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免疫PCR試驗方法的注意事項
點擊次數：294 發布時間：2016-12-16
免疫PCR (Immuno PCR, Im-PCR)是利用抗原抗體反應的特異性和PCR擴增反應的*靈敏性而建立的一種微量抗原檢測技術。是用一段已知DNA分子標記抗體作為探針，用此探針與待測抗原反應，PCR擴增粘附在抗原抗體復合物上的這段DNA分子，電泳定性，根據特異性PCR產物的有無，來判斷待測抗原是否存在。
免疫PCR主要由兩個部分組成，*部分的免疫反應類似于普通的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的測定過程；第二部分即通常的PCR檢測，抗原分子的量zui終由PCR產物的多少來反映。*步中，首先用待測抗原（如牛血清白蛋白（ESA））包被微滴板孔，再加入相應的特異抗體，于是抗體就與固相上的抗原結合形成抗原抗體復合物，蛋白A-鏈親合素（Protein A-Streptavidin）嵌合體（重組融合蛋白）中的蛋白A部分可與固相上抗原抗體復合物中的抗體IgG結合，而鏈親合素部分可與*化的pUC19（質粒DNA) (Biotin-pUC19）中的*反應，從而將特定的DNA間接吸附于固相。接下來，就是第二步中的PCR過程，*步中吸附于固相的pUC19質粒DNA在相應的引物存在下，可經PCR在幾小時內而放大數百萬倍，PCR產物的多少與固相上抗原的量成正比。
其注意事項如下：
該實驗的關鍵步驟是獲得適當的抗體-DNA復合物。用鏈親和素將*標記的抗體與*標記的DNA偶聯的方法，因每個鏈親和素分子可與四個*分子結合，因此要優化反應條件，以使得每個鏈親和素分子既能結合上抗體分子，又能結合上DNA片段。
此外，還可用化學方法將DNA片段與抗體分子共價偶聯，即將抗體分子和5’端氨基酸修飾的DNA片段分別用不同的雙功能偶聯劑激活，然后通過自發的反應偶聯到一起。
免疫PCR具有高敏感性。因此，抗體和標記DNA的任何非特異性結合均可導致嚴重的本底問題。因而在加入抗體和標記DNA后必須盡可能*地清洗。即使有些特異性結合的抗體或標記DNA被洗掉了，亦可在zui后通過增加PCR的循環次數得到彌補。此外，應用有效的封閉劑對防止非特異性結合也是非常重要的。可用脫脂奶粉和牛血清白蛋白做蛋白封閉劑，用魚精DNA做核酸封閉劑。防止本底信號的另一個重要因素是控制污染，這也是所有敏感的檢測系統存在的問題。即使每一步試驗都做得非常認真，重復使用同樣的引物和標記DNA均會產生假陽性信號。