雙抗體夾心法 1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。 2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。 3. 加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。 4. 加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。 5. 終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。 間接法 1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜； 2.次日洗滌3次； 3.加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌； 4.（同時做空白、陰性及陽性孔對照）于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml； 5.37℃孵育35-60分鐘，洗滌； 6.’zui后一遍用DDW洗滌。 其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
操作注意事項： 1、在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆； 2、當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡； 3、洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性； 4、一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，*使用排槍加樣； 5、如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數； 6、請每次測定的同時做標準曲線，做復孔； 7、不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑； 8、底物請避光保存。
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