牛β乳球蛋白(β-Lg)ELISA試劑盒　　

尊敬的客戶，感謝你選用本公司的產品。本產品適用于體外定量檢測牛血清、血漿或細胞培養上清液、組織等中天然和重組的β-Lg濃度。檢測其他特殊樣本請咨詢本公司。試劑盒僅供科研使用。 使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑盒組分。 如有疑問，請武漢新啟迪生物科技有限公司。 您將得到我們的服務。

本試劑盒采用雙抗體夾心法，雙抗體夾心原理，是基于要測試的抗原具有二價以上的特性，能識別包被抗體，同時能識別檢測抗體，具體過程如下：

1. 將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌除去未結合的抗體及雜質，并用無關蛋白封閉空余結合位點。
2. 加受檢標本使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
3. 加*標記抗體，使固相免疫復合物上的抗原與*標記抗體結合。*洗滌未結合的*標記抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
4. 加辣根過氧化物酶標記親和素，使*標記抗體與辣根過氧化物酶標記的親和素結合。*洗滌未結合的酶標記物。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
5. 加入底物顯色，即可計算標本濃度。
6. 注：一個抗體分子上可以標記上若干個*分子，一個*分子可以結合一個辣根過氧化物酶標記的親和素，從而帶來了大量的辣根過氧化物酶結合到抗體上，比傳統的直接辣根過氧化物酶標記抗體具有更高的敏感性和放大效應。

【牛β-Lg酶聯免疫試劑盒檢測原理】

本實驗采用雙抗體夾心ELISA法。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯免疫吸附測定試劑盒（ELISA）。預先包被的抗體為抗牛β-Lg單克隆抗體。檢測相抗體為多克隆抗體，經*（biotin）標記。樣品和*標記抗體先后加入酶標板孔反應后，PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應；經過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測因子呈正相關。

【牛β-Lg酶聯免疫試劑盒檢測原理示意圖】

 *步            第二部

第三步            第四步

【試劑盒組成】

名稱                             96 Tests            48 Tests                     保存條件

1．牛β-Lg抗體包被板條                  8×12                  8×6                            4/-20℃

2．牛β-Lg標準品                             2 支（凍干）     1 支（凍干）            4/-20℃

3．濃縮*化牛β-Lg抗體           1支                     1 支                          4/-20℃

4．濃縮酶結合物(ABC)                     1支                     1 支                        4/-20℃

5. 酶結合物(ABC)稀釋液           1瓶             1瓶               4/-20℃

6．抗體稀釋液                    1瓶                     1 瓶                          4/-20℃

7．標準品稀釋液                  1瓶                     1 瓶                          4/-20℃

8．樣品稀釋液　                  1瓶                     1 瓶                          4/-20℃

9．濃縮洗滌液                                  1 瓶（25×）       1 瓶（25×）              4/-20℃

10．顯色劑A                                   1 瓶                   1 瓶 (避光)               4/-20℃

11．顯色劑B                                   1 瓶            1 瓶                    4/-20℃

12．終止液                                      1 瓶            1 瓶                          4/-20℃

13．說明書                                     1 份            1 份                          室溫

【試驗所需自備試驗設備和器材】

1. 酶標儀(450nm檢測波長濾光片，570nm或630nm校正波長濾光片) 。
2. 洗板機（可調注液量，保證每孔350μl洗液而不溢出）。
3. 超凈工作臺，生物安全柜，通風柜。
4. 高精度單道加液器（量程為0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl).
5. 高精度多道加液器（8道或12道，量程為50-300μl).
6. 37℃恒溫箱。
7. 低溫離心機。
8. 電冰箱（4℃,-20℃,-86℃）.
9. 分析天平。
10. 剪刀，鑷子，鉗子等。
11. 漩渦混合儀，低頻振蕩器等。

【試驗所需自備試驗耗材及試劑】

1. 離心管（容量為1.5ml，5ml等）。
2. 一次性吸頭（量程為0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl）.
3. 純凈水或蒸餾水。
4. 坐標紙。
5. 吸水紙。
6. EDTA，*，肝素

【標本收集注意事項】

1. 收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。
2. 血清和血漿避免使用溶血，高血脂標本。
3. 標本應清澈透明，懸浮物應離心去除。
4. 標本收集后若不及時檢測，需按一次使用量分裝，凍存于-20℃，-80℃電冰箱內，避免反復凍融。 
5. 可根據標本的實際情況，做適當倍數稀釋(建議做預實驗，以確定稀釋倍數) 。
6. 收集標本，盡量做到雙份的用量，避免一次實驗失敗，重復實驗時標本缺失，從而耽誤實驗進程。
7. 收集標本時，應該做好防護措施（比如戴手套，口罩，護目鏡等），認為所有標本都具有一定的潛在危險性。
8. 樣本處理應該在生物安全柜里面，并且正確使用生物安全柜。

【標本處理辦法】

1. 血清：將采集的全血靜置冰箱4℃過夜，然后1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存。
2. 血漿：用EDTA，*，肝素等作為抗凝劑，加入血液混勻后，1000-3000rpm離

    心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）

    保存。

1. 組織勻漿：切取組織塊，0.01MPBS中過洗一次；按照1G組織加入5-10ml組織蛋白萃取試劑的比例，在冰水中勻漿。勻漿完成后，5000-10000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存。
2. 細胞培養上清：1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存。
3. 尿液，腹水，腦脊液等：1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃3-6個月）保存。

注：樣品稀釋的一般原則

用戶須查閱相關文獻了解標本內待測因子的含量，決定適當的稀釋倍數，以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的*檢測范圍。樣品的稀釋應有詳細記錄。

【注意事項】

1. 試劑盒使用前請保存在2-8℃。除復溶后的標準品，其他成分不可凍結。
2. 濃縮*化牛β-Lg抗體，濃縮酶結合物體積小，運輸中顛簸和可能的倒置，會使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000rpm離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。
3. 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，使結晶*溶解后再配制洗滌液。
4. 測試過程中，牛β-Lg凍干標準品為一次性使用，不得分裝。因其濃度較低，溶解兩小時候后，會迅速失活。
5. 操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。
6. 配制試劑時，要用旋渦混合儀混勻。加入孔內的試劑，充分混勻對測試結果尤為重要，使用微量振蕩器(使用zui低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應前手工輕輕晃動酶標板1分鐘，例如做圓周動作，使加入孔中的反應液混勻。
7. 實驗用酶標儀應嚴格按使用說明書規范操作，并在使用前充分預熱。
8. 酶免試驗中牛β-Lg標準品和樣本檢測時建議作復孔。
9. 將不用的微孔板放進原鋁箔袋中，置2-8℃保存。
10. 顯色液對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
11. 超過使用有效日期的試劑盒不能應用于實驗中。
12. 試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準，使用雙波長檢測時，波長應該設置為450nm和630nm.
13. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按生物廢棄物處理。終止液為2M硫酸，使用時必須注意安全。
14. 各步驟加樣均應使用加樣器，并經常校準其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，*使用排槍加樣。
15. 每次試驗測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔zui高濃度的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數（×n）。
16. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
17. 以洗板機洗板時,每孔注液量不應少于350μl, 注意檢查加樣頭是否堵塞。手工洗板時, 用帶紙屑的吸水材料應慎重, 防止外源性過氧化物酶類似物或氧化還原物與顯色劑發生反應。
18. 用終止液終止反應后，請于10分鐘內讀取OD值。
19. 進行復孔實驗時，結果計算一定要求平均值。
20. 標本溶血可能會有假陽性結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
21. 試驗時，應該將加過樣品的板條放于密閉盒內，并保持濕度約60%左右。
22. 為保證恒溫箱內的溫度為37℃，恒溫箱的溫度要經常校準。以確保實驗溫度保持恒定。
23. 48T的試劑盒，所有組分均為96T的50%的量。
24. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

【檢測前準備工作】

1. 請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫后方可進行試驗。

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回 。

3. 牛β-Lg標準品: 加入標準品稀釋液1.0ml至凍干牛β-Lg標準品中，靜置10分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為10 ng/ml)，之后在管身標注①，然后根據需要進行稀釋。(建議標準曲線使用以下濃度：10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156 ng/ml)。 注意：務必要保證凍干標準品*溶解和混勻。

4. 標準品稀釋方法圖例： 取7支潔凈的試劑管，分別標注②,③,④,⑤,⑥,⑦,⑧.  每管加入300μl標準品稀釋液。從第①管內取出300μl加入到第②管，混勻后，再從第②管取出300μl加入到第③管，以此類推至第⑦管。第⑧管為標準品稀釋液，作為陰性對照使用。