實驗步驟

1. 大鼠以3％戊*鈉60mg/kg麻醉后，依次碘酒、乙醇消毒；

2. 以十字型切口打開腹腔，暴露內臟，將腸管推向腹腔的左側，暴露出下腔靜脈和門靜脈，首先游離出下腔靜脈，將膽總管結扎。然后分離門靜脈，將其分支一一結扎，并在門靜脈的近端和遠端分別預置“0”號絲線一根，用針管內預先吸有肝素的l8號*穿刺門靜脈，退出針芯，見門靜脈有回血后結扎固定，迅速接通灌注系統，并剪開下腔靜脈建立流出道，以20ml/min的速率灌注預灌注液（37℃），同時將肝臟完整地分離下來，置入一平皿中；

3. 灌注約10 min后，肝臟*變為淡黃褐色，關閉預灌注液三通開關，以15 ml／min速率灌注50 ml（25 mg）鏈蛋白酶E灌注液，然后再以15 ml／min速率灌注含Ⅳ型膠原酶的灌注液（37℃）；

4. 將一根一次性輸液管一端浸入培養皿液面以下，另一端插入*瓶，建立膠原酶的循環灌注；

5. 20～25 min后，當肝臟組織*變軟，撕去肝包膜，去除結締組織，鈍性粉碎肝組織制備細胞懸液；

6. 將細胞懸液倒入一預先裝有100 ml、37℃預熱的振蕩消化液硅化三角燒瓶中，將三角燒瓶放恒溫振蕩器中振蕩消化30 min （200 r／min，37℃），振蕩消化后的細胞懸液依次經120目、300目鋼網過濾，收集于2個50ml聚丙烯離心管中；

7. 1700 r／min離心5 min（4℃），吸棄上清液。每管加入40 ml RPMI 1640液，反復吹打，使細胞充分懸浮；

8. 200 r/min離心2 min （20℃）2次，使細胞懸液中剩余的肝細胞沉淀，去除肝細胞；

9. 上清液l 700 r／min離心5 min（4℃），沉淀肝的非實質細胞，吸棄上清液，用RPMI 1640液1700 r／min離心5 min（4℃）再沖洗2～3次；

10. 將33％的Histodenz液以RPMI 1640液稀釋成為11％ Histodenz液，加入l1％ Histodenz液重懸細胞沉淀，反復輕柔吹打，使細胞充分懸浮；

11. 配制15％的Histodenz液，在10 ml離心管的底部先小心地鋪4ml 15％的Histodenz，然后將l1％Histodenz細胞懸液小心地鋪在1 5％的Histodenz液上，上面再小心地滴加一層無血清的RPMI 1640細胞培養液。在這一過程中一定要避免各層液體混合；

12. 兩離心管3 000 r／min離心30 min（4℃），垂直位小心取下離心管，可以看到明顯的細胞分層，將11％ Histodenz液與15％ Histodenz液交界面間的細胞仔細地吸出，用無血清RPMI 1640液1700 r／min離心5 min（4℃）沖洗2次；

13. 培養：用含體積分數20％胎牛血清的RPMI 1640培養液將細胞懸浮，移人培養瓶，于37℃、CO₂體積分數為5％的培養箱中培養30min，計數，以1×10⁶個／ml的濃度接種于新瓶中培養，24 h后洗去未貼壁的細胞，即可獲得純化的大鼠肝細胞。