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如何減少ELISA試劑盒實驗中背景因素的影響？
2018-4-24 閱讀(594)
ELISA試劑盒實驗的原理似乎很簡單，不外乎固定抗原，添加一抗、二抗和底物，間中夾雜著
洗滌和封閉。然而，即使是平淡無奇的洗滌和封閉，如果做得不太好，也有可能毀了整個實驗
。在實驗結束時，我們是否能獲得有意義的信息，這在很大程度上取決于結果的信噪比。背景
噪音會影響您對結果的判斷。如何降低ELISA的背景，下面有一些tips。
洗滌很重要
洗滌步驟看似很無聊，其實很重要，因為如果未結合的材料(如非特異結合的抗體或檢測試劑)
殘留在微孔板中，那么它會增加背景噪音。如有必要，可增加洗滌液中的鹽濃度，這會阻止非
特異結合反應。如果背景過高，而您懷疑洗滌不夠時，可以嘗試增加洗滌次數。
封閉更關鍵
封閉液的作用是讓不相關的蛋白占據微孔板中潛在的結合位點。這就降低了可產生信號的抗體
非特異結合的機會。您當然也希望抗體只與目的蛋白結合吧。如果您的背景過高，懷疑封閉不
充分，那么您可以嘗試使用更高濃度的封閉液，或適當延長封閉時間。
如果您一直被背景問題所困擾，那么也許您該花些時間來優化封閉液。這可能需要時間，但也
是值得的。目前主要有兩種類型的封閉液：蛋白和非離子型去污劑。您使用的類型須取決于多
個因素，包括微孔板的表面試劑、吸附的抗原、您的抗體和檢測試劑。好的封閉液應降低非特
異性結合，但它不應當與抗原、抗體或檢測試劑發生相互作用。
zui常用的非離子型去污劑是Tween-20。這種封閉液便宜、穩定，在去除洗滌過程中的一些非特
異結合上很有用。但它們只在存在時起作用，因為很容易被洗掉。因此所有洗滌液中也必須添
加封閉液。請勿使用高濃度(正常濃度為0.01-0.1%)，它會降低特異結合，產生假陰性。另一
個選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液，后者可協助洗滌過程中的封閉。
蛋白封閉液則有所不同，是*的。它們與開放位點結合并封閉，同時穩定與微孔板結合的抗
原分子。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、正常血清和魚明膠。血清組
分的內在多樣性可使它有效攔截許多不同類型的分子相互作用。不過，它的缺點在于能與
Protein A和IgG抗體相互作用。解決這個問題的一種方法是使用雞或魚的正常血清。
抗體濃度須優化
我們通常會follow師兄師姐留下來的操作步驟，但是如果試劑稍有不同，則可能需要優化抗體
的量。記住，非特異的抗體結合會增加背景。為了防止這一點，切勿使用過多的一抗或二抗。
檢測試劑要適量
另一點也很顯而易見：切勿使用過多的檢測試劑。如果濃度過高，或者未正確稀釋，則會導致
高背景。也不要顯色過度，如有必要，優化一下何時應加入終止液。
如果您的ELISA不幸地遇到了高背景，那么也無需太擔心，依次查看ELISA系統中的組分，
并排除可能存在的問題。悉心優化，相信很快就會有漂亮的結果。
