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體液基質(zhì)金屬蛋白酶1活性熒光定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

體液基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP2）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過熒光探針MCA供體和DAP/DNP受體雙重標記的多肽底物PLGLAR，在特定抑制劑存在與否的情況下，受到MMP1蛋白酶的水解，解離抑制基團，產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，即采用熒光法來測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物和人體體液包括血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液、精液等樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶1的特異活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。

技術背景

基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一類結(jié)構(gòu)高度同源的分泌型或膜相關性鋅內(nèi)肽酶的總稱，因含有金屬（鋅、鈣）離子而得名。其功能在于分解細胞外基質(zhì)成分。迄今為止發(fā)現(xiàn)的MMPs至少有28種，幾乎能降解除多糖以外的全部細胞外基質(zhì)（extracellular matrix）成分，同時參與胚胎發(fā)育、形態(tài)形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、組織再吸收（tissue resorption）、疾病發(fā)生，例如關節(jié)炎、癌細胞浸入轉(zhuǎn)移等。根據(jù)降解的底物不同可將MMPs分為4大類：（1）膠原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和蛋白多糖；（2）明膠酶（Ⅳ型膠原酶）：MMP2、MMP9，又稱明膠酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和彈性纖維；（3）基質(zhì)溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11、MMP12，主要作用于纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈力纖維、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ膠原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金屬蛋白酶：MT₁-MMP、MT₂-MMP、MT₃-MMP，主要作用于明膠、Ⅳ型膠原、MMP2。體內(nèi)絕大多數(shù)細胞并不儲備MMPs，當需要MMPs的信號傳遞到細胞后才臨時合成，合成的MMPs以無活性的酶原（proenzyme）形式分泌到細胞外，隨后被多種蛋白酶和非蛋白酶水解以及熱處理激活，一種激活的MMPs可激活另一種MMPs，形成瀑布效應。基質(zhì)金屬蛋白酶-2，又稱明膠酶A （gelatinase-A）或IV型膠原酶（type IV collagenase），其前體分子量為72kDa，激活后分子量為62和56 kDa。它在血清或細胞上清中濃度通常為10至200納克/毫升。它的作用目標是天然和變性膠原蛋白（collagens）、纖維連接蛋白（fibronectin）、彈性纖維蛋白（elastin）、層粘連蛋白-5 （laminin-5）、前體腫瘤壞死因子-α（pro-TNF-α）和神經(jīng)（蛋白）聚糖（neurocan）。基質(zhì)金屬蛋白酶-2與腫瘤發(fā)展與轉(zhuǎn)移、血管形成、動脈粥樣硬化等疾病有關。基質(zhì)金屬蛋白酶-1，又稱間隙性膠原酶 （interstitial collagenase）或成纖維細胞膠原酶（fibroblast collagenase），其前體分子量為52（未糖基化）和57（糖基化）kDa，激活后分子量為42和47 kDa。它的作用目標是纖維膠原蛋白（fibrillar collagens）。基質(zhì)金屬蛋白酶-1與風濕性關節(jié)炎（結(jié)締組織降解）、牙周病（periodontal diseases）和腫瘤發(fā)展轉(zhuǎn)移有關；基質(zhì)金屬蛋白酶-1缺失將導致肌肉骨骼綜合種（musculoskeletal syndrome）。基質(zhì)金屬蛋白酶1的活性檢測通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（Fluorescence resonance energy transfer；FRET），即傳遞激發(fā)狀態(tài)的能量由處于較短波長的供體（donor）到覆蓋供體波長的受體（acceptor），使得距離依賴性反應的供體的散發(fā)光子淬滅（quench）。基于多肽底物PLGLAR兩端標記的供體熒光探針7-甲氧基（7-methoxy courmarin）受到另一個受體基團二硝基苯二氨基異丁酰[N-3-（2,4-dinitrophenyl）-L-α-β-diaminopropionyl；Dap]的抑制而熒光淬滅（quench）。在特異性抑制劑GM1489（N-[(2R)-2-(Carboxymethyl)- 4-methylpentanoyl]- L-tryptophan-(S)-methylbenzylamide）存在與否的條件下，一旦多肽的Gly-Leu鍵受到MMP1水解，釋放出具有強烈熒光的7-甲氧基多肽片段，據(jù)此根據(jù)其熒光強度（激發(fā)波長330nm，散發(fā)波長400nm）的變化，來定量測定基質(zhì)金屬蛋白酶1的特異活性。其反應系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A）        毫升

底物液（Reagent B）        微升

標準液（Reagent C）             微升

專性液（Reagent D）          微升

產(chǎn)品說明書            1份

保存方式

保存在-20℃冰箱里；底物液（Reagent B）和標準液（Reagent C）避免光照，有效保證3月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于標準樣品配制和樣品保存的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于反應孵育

黑色96孔板：用于熒光分析的容器

熒光酶標儀：用于熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、樣品準備

選擇一：血漿樣品

1． 準備好肝素或ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）

2． 抽取1毫升血液，置于抗凝管里

3． 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

4． 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）

5． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

6． 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存

選擇二：血清樣品

1． 準備好不含抗凝劑的儲存管 

2． 抽取1毫升血液，置于儲存管里

3． 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結(jié)

4． 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）

5． 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）

6． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

7． 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存

選擇三：尿液/腦脊液/唾液/精液樣品 

1． 準備好1.5毫升離心管

2． 移取1毫升液體到離心管 

3． 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

4． 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管 

5． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

6． 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存