泛柯為您分析Elisa免疫標記技術實驗原理

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     為提高抗原和抗體檢測的敏感性，將已知抗體或抗原標記上易顯示的物質(zhì)，通過檢測標記物，反映有無抗原抗體反應，從而間接測出微量的抗原或抗體。常用的標記物有酶、熒光素、放射性同位素、膠體金及電子致密物質(zhì)等。這種抗原或抗體標記上顯示物所進行的特異性反應稱為免疫標記技術（immunolabelling technique）。

1.原理

辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）

辣根過氧化物酶 （horse radish peroxidase，簡稱HRP，EC.1.11.1.7）是植物中研究得zui深入的一種過氧化物酶，早在20世紀30年代就有人著手從辣根中分離此酶，以后又制備出結晶。本實驗是以辣根為原料，經(jīng)過水的抽提，硫酸銨和丙酮分級分離，再經(jīng)鋅離子純化，透析除鹽，冰凍干燥，便可得到高純度的辣根過氧化物酶。

辣根過氧化物酶是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，HRP廣泛分布于植物界，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個同功酶組成，Mr在40000左右，等電點7.2。溶于水，溶解度為5%（W/V），溶液呈棕紅色，透明。酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下的硫酸銨溶液。HRP可溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。該酶zui適pH7.0（對愈創(chuàng)木酚為氫給體而言）。在室溫下，HRP幾周內(nèi)穩(wěn)定，加熱到63℃，在15min內(nèi)穩(wěn)定。氧化還原電勢很低，pH6.08時，E 0 =-0.2070V，pH為7.71時，E′0 =-0.2787V。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的純度。* ?# p. n2 ~1 w. X3 b

酶標記物包括酶標記抗原、酶標記抗體和酶標記SPA等。酶標記物質(zhì)量的好壞直接關系到免疫酶技術的成功與否，因此被稱為關鍵的試劑。酶標記物中zui常用的是酶標記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當方法連接而成。酶標記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，高質(zhì)量的酶（如辣根過氧化物酶，簡稱HRP）國內(nèi)已有商品供應。高質(zhì)量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產(chǎn)率高、不影響結合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡便易行的方法。

酶制劑及其底物

凡無毒性又能呈現(xiàn)有色化學反應的酶，原則上均可作為標記用。但作為標記抗體用的酶應滿足下列要求：

（1）來源方便，易于純化;

（2）比活性高，性質(zhì)穩(wěn)定;

（3）酶活性和量能

用簡單方法測定。目前在免疫酶技術中常用的酶為辣根過氧化物酶（HRP）和鹼性磷酸酶（AP），其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、*和蘋果酸脫氫酶等。

由于辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以zui常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個同功酶組成，分子量為40,000,等電點為PH3～9,酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的純度。高純度的酶RZ值應在3.0左右（zui高可達3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度并不表示酶活性，如當酶變性后，RZ值仍可不變。

HRP的催化反應需要底物過氧化氫（H2O2）和供氫體（DH2）。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應可生成有色的氧化型染料（D）。酶促反應的過程如下:

HRP2 ~2 y（ w9 E+ M

DH2+H2O2────→D+2H2O

供氫體的種類很多，形成的產(chǎn)物特點不一。如DAB（3.3-二氨基聯(lián)苯胺）的反應產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。S（5-氨基水楊酸）早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現(xiàn)已很少應用。OT（鄰聯(lián)甲苯胺）的特點是能產(chǎn)生鮮艷的藍綠色產(chǎn)物且靈敏度較高，但反應中受溫度影響較大，而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要在短時間內(nèi)進行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD（鄰苯二胺）和TMB（四甲基聯(lián)苯胺）。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色，后者產(chǎn)物為藍綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無色，靈敏度上據(jù)報道后者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體稱ABTS[2, 2-邊氮基-雙（3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸）]，其反應產(chǎn)物呈藍綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。

由于HRP的底物H₂O₂本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應中使用的H2O2不能過量。應控制在經(jīng)較短時間反應后呈色即達高峰（說明H2O2已消耗殆盡）。這樣即使再延長時間也不會增加反應產(chǎn)物的顏色。

酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種,根據(jù)酶的結構不同可采用不同的方法。對于制備HRP結合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。常用過碘酸鹽氧化法，這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基，醛基與抗體分子上的氨基形成Schiff堿而結合。后者可進一步用NaBH4（或乙醇胺）還原生成穩(wěn)定的酶標記抗體。

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