CYFRA 21-1（化學發光法）ELISA試劑盒

時間：2013-9-12閱讀：344

預期用途

此試劑盒基于化學發光免疫原理，用于血清和肝素血漿中CYFRA 21-1的檢測，此試劑盒僅用于研究

說明

此試劑盒采用兩種鼠單抗KS19.1和BM19.21來檢測細胞角蛋白19片段

實驗原理

此試劑盒采用的是化學發光免疫法，基于夾心原理包被板上包被有能結合CYFRA 21-1分子上*抗原位點的單克隆小鼠抗體，含有內源性CYFRA 21-1的樣品與HRP標記的抗CYFRA 21-1抗體酶聯物共同孵育，洗去未結合的酶聯物，樣品中CYFRA 21-1的濃度與結合的酶聯物的量成正比，加入底物液之后，樣品中的CYFRA 21-1濃度與顏色強度成正比

注意事項及預防措施

1.試劑僅供專業人士使用

2.試劑盒中的所有試劑包括檢測過的人血清/血漿對HIV/II，HbsAg和HCV都表現為陰性，所有的試劑在使用和處理的過程中都應當作潛在生物有害物質進行處理

3.開始試驗前，請仔細閱讀說明書，確定所有的事項都已明白

4.微孔板是可拆的，不用的板條應固定在板架上，裝在密封袋內保存于2-8℃

5.加樣時應按相同的順序快速加樣

6.不同的試劑裝在不同的試劑瓶內，不能混用，如果用事先裝了酶聯物的瓶子再裝底物液，則顏色會發生變化。不要將剩余的試劑倒回原裝瓶內，以免污染

7．充分混勻孔內成分，以達到很好的試驗結果。微孔板不可重復使用

8.試驗過程中，不要讓孔內出現干燥情況，洗板步驟過后應立即加樣

9.試驗開始前，所有試劑平衡至室溫，溫度會對試驗結果有影響

10.不要用嘴吸取樣品，避免皮膚接觸到試劑和樣品

11.實驗區內禁止飲食或化妝

12．處理試劑和樣品時應戴一次性手套。微生物污染可能會導致結果失敗

13.按照相應的國家生物安全管理條理進行操作

14.不要使用過期的試劑

15.所有試劑的量都應按說明來，使用校正的移液器和發光儀可得到*的結果

16.發光底物液對光敏感，應避免陽光直射，保存于黑暗處

17.不要混合使用不同批次的試劑，板條。試劑盒的運輸和貯存環境不同可能會導致結果有微小的區別

18．有些試劑內含有Proclin300，BND和MIT作為防腐劑，萬一眼睛或皮膚接觸到了應立即用水沖洗

19.按照相應的國家生物安全管理條理*的方法處理樣品和試劑

20.有害物質的相關信息請參考MSDS，產品的MSDS可直接向DRG索取

試劑盒組成

1. 微孔板，12x8, 96孔，可拆，包被有抗CYFRA 21-1抗體（單克隆）

2.標準品，0-4,5支，凍干粉，1.0ml，濃度為：0；3；10；25；50ng/ml 含0.03%的Proclin300，BND和0.01%的MIT作防腐劑

3.質控，1支，1.0ml，質控值和范圍請見QC質控單含0.03%的Proclin300，BND和0.01%的MIT作防腐劑

4.樣品稀釋液，1支，3ml，即用，含0.03%的Proclin300，BND和0.01%的MIT作防腐劑

5.酶聯物，21X，1支，0.5ml，HRP標記的抗CYFRA 21-1抗體，含0.03%的Proclin300，BND和0.01%的MIT作防腐劑

6.酶聯物稀釋液，1支，7ml，即用，含0.03%的Proclin300，BND和0.01%的MIT作防腐劑

7．底物液

試劑A，1支，2.0ml，注意：光敏感

試劑B，1支，2.0ml，注意：光敏感

試劑C，1支，5.0ml

8. 洗滌液，1支，30ml，40X

實驗所需材料但試劑盒未提供

1. 發光光度計

2. 校正的移液器

3. 吸水紙

4. 去離子水或雙蒸水

5. 計時器

6.半對數坐標紙或數據處理軟件

貯存條件

未開封的試劑在2-8℃下可保存至有效期，不要使用過期的試劑

打開的試劑必要保存在2-8℃，微孔板也保存于2-8℃，一旦打開了微孔板的袋子，需小心地將其重新密封

注意：配制標準品和質控品在2-8℃下可保存至少4周，在-20℃下可保存更長時間

試劑準備

實驗前將所有試劑平衡至室溫

標準品

向標準品瓶內加1ml去離子水配制

2-8℃下可保存至少4周，在-20℃下可保存更長時間

質控品

向質控品瓶內加1ml去離子水，放置10min，使用前反復混勻

2-8℃下可保存至少4周，在-20℃下可保存更長時間

洗滌液

加去離子水稀釋40X的濃縮洗滌液

30ml的濃縮洗滌液+1170ml的去離子水，即得1200ml的工作洗滌液

室溫下可保存2周

酶聯物

用酶聯稀釋液以1:21的比例稀釋

配制的酶聯物24小時內使用

例如：如果板條全部使用，吸取300ul的濃縮酶聯物，加上6ml的酶聯物稀釋液，即得

如果板條不全使用，吸取25ul的濃縮酶聯物，加上0.5ml的酶聯物稀釋液，即得相關酶聯物制備見下表

板條數	酶聯濃縮物（ul）	酶聯稀釋液（ml）
1	25	0.5
2	50	1.0
3	75	1.5
4	100	2.0
5	125	2.5
6	150	3.0
7	175	3.5
8	200	4.0
9	225	4.5
10	250	5.0
11	275	5.5
12	300	6.0

化學發光底物液

試劑A和試劑B混合，然后以1:2的稀釋比例用試劑C稀釋，即得即用的底物液現配現用，只能保存1小時如果所有板條都使用，則試劑A和試劑B各1.5ml混合+3ml的試劑C

樣品采集和準備

試驗可采用血清和肝素血漿

檸檬酸鹽血漿值減小，EDTA血漿值增高

不要使用溶血，黃疸或脂血的樣品

注意：不要使用含有疊氮化物的樣品

樣品采集

血清

靜脈穿刺采血，允許凝集，室溫下離心分離出血清。未*凝固時不可進行離心。接受了抗凝劑治療的捐獻者的血液凝集時間更長

血漿

將全血收集到含有抗凝劑的離心管內，采集后立即離心

樣品貯存和準備

實驗前，將樣品蓋上蓋子，貯存于2-8℃，可保存2天，想保存更長時間則需凍存于-20℃，避免反復凍融

樣品稀釋

在zui初的試驗中，如果樣品濃度高于zui高標準品濃度，則應用樣品稀釋液進行稀釋

結果計算時應乘以稀釋因子

例如：

A）1:10稀釋 10ul血清+90ul樣品稀釋液（充分混勻）

B）1:100稀釋 10ul稀釋液A）1:10+90ul樣品稀釋液（充分混勻）

實驗操作

操作注意事項

1. 實驗前將所有試劑平衡至室溫，混勻，不產生氣泡

2. 實驗一旦開始，所有步驟必須完整的進行下去

3.避免污染試劑，槍頭和微孔/管。每個微孔的加樣都應該用新的槍頭，避免交叉污染

4.實驗前將所有試劑準備好，蓋子打開，所需板條固定等，這樣可以確保每個步驟間隔時間一致，無中斷。

5.酶免反應中時間和溫度成線性關系

實驗步驟

每次檢測都應建立一標準曲線

1. 將實驗所需板條固定于板架上

2.加50ul的標準品，質控品和樣品于相應的孔內

3.每孔加50ul現配的酶聯物，充分混勻10秒，充分混勻這一步很重要

4.室溫下孵育30min（無需蓋板）

5.棄去孔內廢液，每孔300ul的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干

重要提醒：洗板過程直接會影響到實驗的靈敏度和度

6.每孔加50ul現配的底物液

7.室溫下孵育10min

8.加入底物液20min內在發光光度計上讀數

結果計算

1.計算各標準品，質控品和樣品的RLU平均值

2.在半對數坐標紙上，以標準品的RLU的均值為Y軸，濃度為X軸繪制標準曲線

3.從標準曲線上通過RLU均值找到相對應的濃度值

4.全自動法：自動法用zui合適的4參數對數擬合法計算，它是計算方法，其他方法得出的結果可能會有細微的區別

5.樣品濃度可直接從標準曲線上讀取，樣品濃度高于zui高標準品濃度的則需進一步稀釋，或記錄為＞50ng/ml。結果計算時要乘以稀釋因子

使用局限性

試驗中嚴格按照說明書操作和良好的實驗操作習慣可得到*試驗結果

任何不恰當的處理或試驗步驟的改動都會對結果造成影響

干擾底物

以下物質低于下面所述濃度，其實驗結果都會不明顯

血紅蛋白	4mg/ml
*	0.5mg/ml

試驗中含有減低嗜異性抗體干擾作用的試劑，然而，高滴定量的HAMA和嗜異性抗體可能會對試驗結果產生干擾

藥物干擾

目前為止還沒有一種藥物對CYFRA 21-1檢測會產生影響

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