線蟲unc-22突變基因
實驗原理
外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA 連接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的連接緩沖系統中，將載體分子與外源DNA分子進行連接。Taq DNA聚合酶擴增的PCR產物，其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與pMD18-T Vector 末端游離的T堿基互補形成環狀重組T質粒。將攜帶目的基因的T質粒轉入大腸桿菌并對其進行藍白斑篩選鑒定，挑選出所需的重組質粒。
1. 連接產物的轉化
1） 取出-80℃保存的制備好的感受態細胞，冰上放置10～20min融化；
2） 加入5μl連接產物，輕輕混勻后冰上放置30～40min；
3） 42℃水浴中熱擊90s，輕輕放回冰上冷卻2min；
4） 加入880µl LB液體培養基（不含氨芐*）和20µl葡萄糖，37℃搖蕩培養1h；
5） 制備X-gal平板：取40μl X-gal、 4µl IPTG和56µl滅菌雙蒸水混勻后均勻地涂布于含100µg/μl氨芐*的LB固體培養基平板上，放置1h以充分吸收；
6） 取適量的菌液（200µl），涂布于X-gal平板上，37℃培養1h后，倒置培養14～16h。
2. 重組質粒的篩選
分別挑取白色和藍色單菌落于5ml LB液體培養基中（含100µg/µl 氨芐*），37℃振蕩過夜培養，用堿裂解法抽提質粒DNA。步驟如下：
1） 取適量菌液于1.5 ml的離心管中，瞬時離心，倒掉培養基，盡可能倒干凈；
2） 加溶液I 100μl，渦旋重新懸浮沉淀；
3） 加溶液II 200μl，輕輕搖勻，在冰上放置3～5min使大腸桿菌裂解，釋放質粒DNA；
4） 加預冷的溶液III 150μl，輕輕顛倒搖勻，出現白色絮狀沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反應；
5） 4℃，12000rpm離心8min，轉移上清至1.5ml離心管；
6） 以體積比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，輕輕搖勻，靜置2分鐘；
7） 4℃，12000rpm離心10min，轉移上清至1.5ml離心管；
8） 加入400μl三氯甲烷搖勻， 4℃，12000rpm離心5min；
9） 取上清加2倍體積預冷的無水乙醇，4℃，12000rpm離心8min；
10） 棄上清液,加75%乙醇1000μl洗滌2次，放置干燥；
11） 加50μl 雙蒸水（含20μg/ml的 RNase），37℃保溫2h，電泳檢測（電泳中以藍斑質粒DNA為對照，出現滯后帶的確認為重組質粒）后-20℃保存備用。
3. 重組質粒的測序驗證
將提取純化后的質粒送至上海生物工程公司進行測序得到克隆基因的堿基序列，分析驗證克隆的目的基因的正確性。
