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大鼠磷酸化AKT蛋白（P-AKT）elisa試劑盒上海邦奕——專業的elisa試劑盒供應商，本公司所有產品僅用于科研，不得用于臨床，詳細信息請在線咨詢我公司銷售人員！

大鼠磷酸化AKT蛋白（P-AKT）elisa試劑盒用途：

本試劑盒僅供科研使用，定量檢測細胞液、體液、組織、血清、血漿等標本中大鼠磷酸化AKT蛋白（P-AKT）的含量。

大鼠磷酸化AKT蛋白（P-AKT）elisa試劑盒原理:

   采用雙抗體夾心法測定大鼠磷酸化AKT蛋白（P-AKT）水平。用純化的大鼠磷酸化AKT蛋白（P-AKT）抗體包被微孔板，制成固相載體，實驗時依次在微孔板中加入樣本及標準品，并加入HRP標記的抗體，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，反復洗滌后加底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化為藍色，再用硫酸終止反應，轉變成黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠磷酸化AKT蛋白（P-AKT）含量呈正相關。采用酶標儀在450nm波長測定吸光度（OD值），根據標準曲線，計算測試樣品中大鼠磷酸化AKT蛋白（P-AKT）濃度。           

大鼠磷酸化AKT蛋白（P-AKT）試劑盒組成

儀器與材料：酶標儀（使用前預熱30分鐘），微量加液器、吸頭、蒸餾水或去離子水，濾紙。實驗材料與試劑配制：

2. 洗液的配制：按1:30的比例配制洗液備用。

樣品收集、處理及保存

細胞培養上清：適用于檢測體外培養的細胞分泌性成份。用無菌管收集細胞上清液，以1000×g離心15分鐘，收集上清。

細胞：用PBS反復洗滌細胞3次，調整細胞濃度達到104-106/ml 左右，通過反復凍融，使細胞破壞并放出細胞內成份，或者細胞超聲粉碎，離心取上清液檢測。

血清：在室溫下，血液自然凝固，以1000×g離心15分鐘，取上清待測。

血漿：應根據標本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合后靜置10-20 分鐘后，以1000×g離心15分鐘，收集上清。

體液：包括胸腹水、腦脊液，分泌物等。使用不含熱原和內毒素的離心管收集，以1000×g離心15分鐘，收集上清。

組織標本：切取組織標本，稱取重量0.5mg，加入500ul 的PBS，用手工或勻漿器，或超聲破碎儀將標本勻漿，以2000-3000 rmp離心20 分鐘，收集上清進行檢測。

樣品中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

保存：如果樣品不能立即檢測，應將其分裝，-70 ℃保存，避免反復冷凍。保存過程中如出現沉淀，應再次離心。血液標本盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

大鼠磷酸化AKT蛋白（P-AKT）elisa試劑盒操作步驟： 

取出試劑盒，室溫（20-25℃）放置30分鐘。

分組：取出96孔板，根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數，把剩余的板條繼續冷藏處理。分別設標準品組（6個濃度）、空白孔、待測樣品組。

標準品的稀釋：準備小試管6 只，依次編好號碼，先在各小試管中加入標準品稀釋液100ul，然后取原濃度標準品100ul 加入一只已編好號的試管中，充分混勻;再在該試管中取100ul 加入第二支試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul 加入第三只試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul 加入第四只試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul 加入第五只試管中，充分混勻；然后在該試管中取100ul，棄掉。第六只試管作為0 號標準品。

注：為減少實驗誤差，保證準確性，建議設置復孔。

加樣：依照標準品的順序分別加入50ul的標準品溶液于空白微孔中；空白對照孔加入50ul的蒸餾水；其余微孔中先加樣品40ul然后再加*標記的抗體10ul。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。

洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒棄去，如此重復5 次，拍干。

加酶標溶液：標準品組、待測樣本組各孔中加入50ul的酶標溶液（空白對照孔除外）。

溫育：酶標板用封板紙密封后，放入濕盒內于37℃恒溫孵育1小時。

洗板：用稀釋后的洗滌液注滿每孔，靜置15-30s，充分清洗酶標板5次，用吸水紙*拍干。

顯色：各孔加入顯色劑A液50ul后，再加入顯色劑B液50ul。

終止：25-37℃下避光反應10-15分鐘，加入50ul終止液。

讀板：在450nm波長讀取各孔的OD值。

注：讀板時必須拭干板底殘留的液體和手指痕跡，讀板時間控制在終止反應后的30分鐘內，以免影響準確性。

大鼠磷酸化AKT蛋白（P-AKT）elisa試劑盒數據計算：

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，即為樣品的實際濃度。

大鼠磷酸化AKT蛋白（P-AKT）elisa試劑盒注意事項：

實驗操作中必須使用一次性吸頭，避免交叉污染。

加樣：加樣時，要控制加樣速度，避免*孔與zui后一孔間的時間間隔過大，否則將會導致不同的預孵育時間，從而影響實驗的準確性以及重復性。

孵育：嚴格按照說明書上規定的孵育時間和溫度進行。

反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化，如果顏色較深，請提前加入終止液終止反應。

建議實驗前預測樣品含量，如樣品濃度過高，應對樣品進行稀釋，計算結果時乘以相應的稀釋倍數。

建議使用本試劑盒時先做預實驗（即先做標準曲線，試用幾個標本），如果對本試劑盒有任何疑問，可和所購經銷商，如果因運輸過程導致試劑盒失效，可要求調換，但概不承擔產品本身以外的任何損失。

安全性

1． 避免人體直接接觸顯色劑A、B和終止液。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

2． 實驗中不要進食、抽煙或使用化妝品。

3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

大鼠磷酸化AKT蛋白（P-AKT）elisa試劑盒保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：2-8℃

2.有效期：6個月

本公司對所有售出的產品保證質量，并提供良好的售后服務，有關產品質量的投訴，請在收到貨物的30天內以書面形式提出，并向我公司技術人員提供相應的材料，我們會及時派人解決。所有形式的賠償或退換*于產品本身，不涉及其他間接內容。凡購買本公司任意款elisa試劑盒，均可享受免費代測服務，并提供技術指導。

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